Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados.

Un procedimiento para la producción de compuestos de la siguiente fórmula general I**Fórmula**

en planta que produce aceite transgénica con un contenido de al menos el 1 % en peso de dichos compuestos referido al contenido en lípidos total de dicha planta que produce aceite que comprende las siguientes etapas:

a) introducción de al menos un ácido nucleico en una planta que produce aceite transgénica, que codifica una Δ-9-elongasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 3, e

b) introducción de al menos un segundo ácido nucleico que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 1 y

c) si es necesario introducción de al menos un tercer ácido nucleico, que codifica una Δ-5-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.ºs: 5, 7 o 9, y

d) cultivo y cosecha de dicha planta que produce aceite; y

donde las variables y sustituyentes en fórmula I tienen los siguientes significados:

R1 ≥ hidroxil-, Coenzima A-(Tioéster), fosfatidilcolina-, fosfatidil-etanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido- o un residuo de fórmula general II:**Fórmula**

R2 ≥ hidrógeno-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido- o -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, R3 ≥ hidrógeno-, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientes el uno del otro son un residuo de la fórmula Ia:**Fórmula**

n ≥ 3, 4 o 6, m ≥ 3, 4 o 5 y p ≥ 0 o 3.

Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado de producción específica de ácidos grasos ω-3 y ω-6 poliinsaturados y a un procedimiento para la producción de triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, en particular ácidos grasos ω-3 y ω-6 que tienen al menos dos enlaces dobles y una longitud de cadena de 20 o 22 átomos de carbono. La invención se refiere a la producción de un aceite transgénico que produce una planta, que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que contienen ácidos grasos de C20 o de C22 con un doble enlace Δ5, 7, 8, 10, debido respectivamente a la expresión de una Δ8-desaturasa y una Δ9-elongasa de organismos tales como plantas preferentemente algas como Isochr y sis galbana o Euglena gracilis. Además la invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido Eicosapentaenoico, Araquidónico, Docosapentaenoico o Docosahexaenoico por la coexpresión de una Δ-8-desaturasa, una Δ-9-elongasa y una Δ-5 desaturasa en organismos tales como plantas.

La invención adicionalmente se refiere al uso de secuencias de ácidos nucleicos específicas que codifican para las proteínas mencionadas anteriormente con actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa o Δ-5-desaturasa, construcciones de ácidos nucleicos, vectores y organismos que contienen dichas secuencias de ácidos nucleicos. También se describen ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de al menos el 1 % en peso de ácidos grasos insaturados y uso de los mismos.

Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria alimentaria, la nutrición animal, los cosméticos y el sector farmacéutico. Dependiendo de si son ácidos grasos saturados o insaturados libres o triglicéridos con un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para las aplicaciones más variadas; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados (= PUFA) se añaden a preparado para lactantes para incrementar su valor nutricional. Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente a partir de microorganismos tales como Mortierella o de plantas que producen aceite tales como soja, colza oleaginosa, girasol y otras, donde se obtienen usualmente en forma de sus triglicéridos. Alternativamente, se obtienen ventajosamente de animales, tales como el pescado. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente por hidrólisis.

Si se prefieren los aceites con ácidos grasos insaturados o con ácidos grasos saturados depende del propósito deseado; así, por ejemplo, los lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente con ácidos grasos poliinsaturados, se prefieren en nutrición humana dado que tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre y así en la posibilidad de enfermedad cardíaca. Se usan en una diversidad de productos alimenticios dietéticos o medicamentos. Además PUFA se usan comúnmente en alimentación, piensos y en la industria cosmética. Los ácidos grasos poliinsaturados ω-3 y/o ω-6 son una parte importante de los piensos para animales y de la alimentación humana. Debido a la composición común de los ácidos grasos ω-3 poliinsaturados de alimentación humana, que son un componente esencial del aceite de pescado, deberían añadirse a la alimentación para incrementar el valor nutricional de la alimentación; así, por ejemplo, se añaden ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido docosahexaenoico (= DHA, C22:6Δ4, 7, 10, 13, 16, 19) o ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5Δ5, 8, 11, 14, 17) como se menciona anteriormente a preparado para lactantes para incrementar su valor nutricional. Tomando en cuenta que DHA tiene un efecto positivo en el desarrollo cerebral de los bebés. La adición de ácidos grasos ω-3 poliinsaturados se prefiere Δ5, 8, 11, 14)

como la adición de ácidos grasos ω-6 poliinsaturados como ácido araquidónico (= ARA, C20:4a la alimentación común tiene un efecto indeseado por ejemplo en enfermedades reumáticas tales como artritis reumatoide. Los ácidos grasos ω-3 y ω-6-poliinsaturados son precursores de una familia de hormonas paracrinas llamadas eicosanoides tales como prostaglandinas que son productos del metabolismo de ácido Dihomo-γ-linoleico, ARA o EPA. Los eicosanoides están implicados en la regulación de lipolisis, la iniciación de respuestas inflamatorias, la regulación de la circulación de la sangre y otras funciones centrales del cuerpo. Los eicosanoides comprenden prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos y prostaciclinas. Los ácidos grasos ω-3-parecen evitar aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares principalmente regulando los niveles de diferentes eicosanoides. Otros Eicosanoides son los tromboxanos y leucotrienos que son productos del metabolismo de ARA o EPA.

Principalmente microorganismos tales como Mortierella o plantas que producen aceite tales como soja, colza o girasol

o algas tales como Cr y tocodinium o Phaeodactylum son una fuente común de aceites que contienen PUFA, donde se obtienen usualmente en forma de sus triacilglicéridos. Alternativamente, se obtienen ventajosamente de animales, tales como el pescado. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente por hidrólisis con una base fuerte tal como hidróxido de potasio o de sodio. Ã?cidos grasos poliinsaturados superiores tales como DHA, EPA, ARA, ácido Dihomo-γ-linoleico (C20:3Δ8, 11, 14) o ácido Docosapentaenoico (= DPA, C22:5Δ7, 10, 13, 16, 19) no se producen por plantas productoras de aceite tales como soja, semilla de colza, cártamo o girasol. Una fuente natural para dichos ácidos grasos son pescados por ejemplo arenque, salmón, sardina, gallineta, anguila, carpa, trucha, fletán, caballa, lucioperca o atún o algas.

A causa de sus propiedades positivas no ha habido escasez de intentos en el pasado para hacer disponibles genes que participan en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos que tienen un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, en el documento WO 91/13972 y su equivalente de los EE.UU. se describe una Δ-9-desaturasa. En el documento WO 93/11245 se reivindica una Δ-15-desaturasa y en el documento WO 94/11516 se reivindica una Δ-12-desaturasa. El documento WO 00/34439 divulga una Δ-5-y una

Δ-8-desaturasa. Se describen otras desaturasas, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 550162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. Hasta la fecha, sin embargo, las diversas desaturasas se han caracterizado bioquímicamente solo inadecuadamente dado que las enzimas en forma de proteínas unidas a membranas son aislables y caracterizables solo con dificultad muy grande (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792) . Generalmente, las desaturasas unidas a membrana se caracterizan por medio de introducción en un organismo adecuado que se investiga para actividad enzimática por medio de análisis de materiales y productos de partida. Las Δ-6-desaturasas se describen en los documentos WO 93/06712, US 5.614.393, US 5614393, WO 96/21022, W00021557 y WO 99/27111 y su aplicación a producción en organismos transgénicos se describe también, por ejemplo en los documentos WO 9846763, WO 9846764 y WO 9846765. Al mismo tiempo se describen y reivindican también la expresión de diversos genes de biosíntesis de ácidos grasos, como en el documento WO 9964616 o en el documento WO 9846776 y la formación de ácidos grasos poliinsaturados.

Se conocen a partir del documento US2002/0138874 A1 la identificación y los usos de varios genes implicados en la elongación de ácidos grasos monoinsaturados, especialmente una elongasa funcionalmente activa, que utiliza un ácido graso monoinsaturado como un sustrato. El documento WO 02/077213 A3 describe un gen de elongasa que codifica un polipéptido que elonga ácido α-linolénico en al menos dos átomos de carbono mientras que el ácido γ-linolénico no se elonga.

Con respecto a la efectividad de la expresión de desaturasas y a su efecto en la formación de ácidos grasos poliinsaturados puede destacarse que por la expresión de desaturasas y elongasas como se describe hasta la fecha solo se han logrado contenidos bajos de ácidos grasos poliinsaturados/lípidos,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de compuestos de la siguiente fórmula general I

en planta que produce aceite transgénica con un contenido de al menos el 1 % en peso de dichos compuestos referido al contenido en lípidos total de dicha planta que produce aceite que comprende las siguientes etapas: a) introducción de al menos un ácido nucleico en una planta que produce aceite transgénica, que codifica una Δ-9-elongasa que tiene la secuencia SEC ID Nº : 3, e b) introducción de al menos un segundo ácido nucleico que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID Nº : 1 y 10 c) si es necesario introducción de al menos un tercer ácido nucleico, que codifica una Δ-5-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID Nº s: 5, 7 o 9, y d) cultivo y cosecha de dicha planta que produce aceite; y donde las variables y sustituyentes en fórmula I tienen los siguientes significados: R1 = hidroxil-, Coenzima A- (Tioéster) , fosfatidilcolina-, fosfatidil-etanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, 15 fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-o un residuo de fórmula general II:

R2 = hidrógeno-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido-o -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado,

R3 = hidrógeno-, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientes el uno del otro son un residuo 20 de la fórmula Ia:

n = 3, 4 o 6, m = 3, 4 o 5 y p = 0 o 3.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquilcarbonil C10-C22 saturado o insaturado.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en las que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquil-carbonil C16-, C18-, C20-o C22 saturado o insaturado.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquilcarbonil C16-, C18-, C20-o C22 con al menos tres dobles enlaces.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la planta transgénica se selecciona del

grupo que consiste en colza oleaginosa, amapola, mostaza, cáñamo, semilla de ricino, sésamo, aceituna, caléndula, granado, avellana, almendra, macadamia, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, onagra, canola, cacahuete,

linaza, soja, cártamo, girasol y borraja.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los compuestos de la fórmula general I están aislados en forma de sus aceites, lípidos o ácidos grasos libres.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los compuestos de la fórmula general I 5 están aislados en una concentración de al menos el 5 % en peso referido al contenido en lípidos total.

8. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEC ID Nº : 1.

9. Polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.

10. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia SEC ID Nº : 1, en la que 10 el ácido nucleico está unido funcionalmente a una o más señales reguladoras.

11. Una planta productora de aceite que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 8 o una construcción génica según en la reivindicación 10.

FIG. 1

Tiempo de retención (min)

FIG. 2

Tiempo de retención (min)

FIG. 3

Tiempo de retención (min)

FIG. 4D

(min)

FIG. 5A

(min)

FIG. 5B

(min)

FIG. 5C

(min)

FIG. 5D

(min)