Nuevas toxinas plaguicidas y secuencias de nucleótidos que codifican estas toxinas.

Una proteina que es activa frente a una plaga de lepidopteranos,

que tiene una identidad de como minimo 95% con la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO. 3

Nuevas toxinas plaguicidas y secuencias de nucleótidos que codifican estas toxinas.

Antecedentes de la invención Los insectos y otras plagas cuestan a los agricultores miles de millones de d6lares anualmente en perdidas de cosechas y gastos para mantener bajo control estas plagas. Las perdidas causadas por las plagas de insectos en los medios de producción agricola incluyen la disminución del rendimiento de la cosecha, la disminución de la calidad de la cosecha y el aumento de los costes de recogida de la cosecha.

Procedimientos de cultivo tales como la rotación de cultivos y la aplicación de niveles de nitrógeno altos para estimular el crecimiento de un sistema de raiz adventicia se han enfrentado parcialmente a los problemas causados por las plagas agricolas. Los demandas económicas sobre la utilización del campo de cultivo restringen el uso de la rotación de cultivos. Ademas, las caracteristicas de algunos insectos de mantenerse vivos durante el invierno rompen en algunas zonas las rotaciones de la cosecha. Asi, los insecticidas quimicos son a los sumo capaces de garantizar el nivel deseado de control. Los insecticidas son aplicados sobre el suelo o incorporados al suelo.

El uso de insecticidas quimicos tiene varios inconvenientes. El uso continuo de insecticidas ha permitido la generación de insectos resistentes. Situaciones tales como poblaciones extremadamente grandes de larvas, lluvias fuertes y un calibrado inapropiado del equipo para aplicar el insecticida pueden dar por resultado un mal control. Con frecuencia, el uso de insecticidas genera preocupaciones tales como contaminación del suelo y de suministro del agua tanto superficial como subterranea. El publico tambien se ha preocupado por la cantidad de productos sinteticos residuales que se pueden encontrar en los alimentos. El trabajo con insecticidas tambien puede suponer riesgos para las personas que los aplican. Por tanto, se estan examinando crecientemente los plaguicidas quimicos sinteticos en cuanto a sus potenciales consecuencias t6xicas ambientales. Entre los ejemplos de plaguicidas quimicos sinteticos extensamente usados figuran los compuestos organocloro, por ejemplo, DDT, mirex, kepone, lindano, aldrina, clordano, aldicarb y dieldrina; los organofosfatos, por ejemplo, clorpirifos, paratión, malatión y diazinón; y carbamatos. Nuevas restricciones exigentes sobre el uso de plaguicidas y la eliminación del mercado de algunos plaguicidas eficaces podrian limitar opciones económicas y eficaces para controlar daros y plagas costosas.

A causa de los problemas asociados con el uso de plaguicidas organicos quimicos sinteticos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La sustitución de plaguicidas quimicos sinteticos, o una combinación de estos agentes con plaguicidas biológicos, podria reducir los niveles de productos quimicos t6xicos en el ambiente.

Un agente plaguicida biológico que goza de una popularidad creciente es el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) . El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria Gram positiva que forma esporas. La mayoria de las cepas de B.t. no exhiben actividad plaguicida. Algunas cepas de B.t. producen inclusiones de proteina paraesporales cristalinas y se pueden caracterizar por ellas. A menudo, estas inclusiones aparecen microscópicamente como cristales conformados distintivamente. Algunas proteinas de B.t. son muy t6xicas para plagas tales como insectos y son especificas en cuanto a su actividad t6xica. Ciertas proteinas de B.t. insecticidas estan asociadas con las inclusiones. Estas β-endotoxinas son diferentes de las exotoxinas, que tienen una gama huesped no especifica. Otras especies de Bacillus tambien producen proteinas plaguicidas.

Se han aislado y secuenciado ciertos genes de toxina de Bacillus y se han producido y aprobado para uso productos basados en ADN recombinante. Ademas, con el uso de tecnicas de ingenieria genetica se estan desarrollando nuevos enfoques para suministrar estas toxinas a ambientes agricolas. Entre ellas figuran el uso de plantas generadas por ingenieria genetica con genes de toxina para resistencia a insectos y el uso de celulas microbianas intactas como vehiculos para suministro de toxinas. Asi, los genes de toxina aislados de Bacillus estan llegando a ser comercialmente valiosos.

Hasta los ultimos quince aros, el uso de plaguicidas de B.t. ha estado restringido en gran medida a la selección de dianas de una gama estrecha de plagas de leptidopteranos (oruga) . Durante muchos aros se han usado como insecticidas comerciales para plagas de lepidopteranos preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis, subesp. kurstaki. Por ejemplo, B. thuringiensis, var. kurstaki HD-1 produce una β endotoxina que es t6xica para las larvas de varios insectos de lepidopteranos.

En los ultimos aros, sin embargo, los investigadores han descubierto plaguicidas de B.t. con especifidad para una gama mucho mas amplia de plagas. Por ejemplo, se han usado otras especies de B.t., a saber, israelensis y morrisoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t., M-7, a.k.a. B.t. san diego) para controlar insectos de los órdenes Diptera y Coleoptera, respectivamnente. Se ha dado cuenta de que B. thuringiensis, var. tenebrionis es activo frente a

escarabajos del orden Coleoptera (escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata y Agelastica alni) .

Mas recientemente se han identificad nuevas especies de B.t. y se han aislado genes responsables de las proteinas de δ-endotoxina. Hofte y Whiteley clasificaron los genes de proteina cristalina de B.t. en cuatro clases principales (Hofte, H., H.R. Whiteley [1989], Microbiological Reviews, 52 (2) .242-255) . Las clases son (Cr y l (especifica para lepid6pteros) , Cr y ll (especifica para lepid6pteros y dipteros) , Cr y lll (especifica para cole6pteros) y Cr y lV (especifica para dipteros) . Se ha dado cuenta del descubrimiento de cepas especificamente t6xicas para otras plagas. Por ejemplo, se ha propuesto que Cr y V y Cr y Vl designen una clase de genes de toxina que son especificos para nematodos.

La nomenclatura de 1989 y el esquema de clasificación de Hofte y Whiteley para proteinas cristalinas estaban basados en la secuencia de aminoacidos deducida y la gama huesped de la toxina. Ese sistema se adapt6 para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxina que se dividieron en cinco clases importantes. El numero de genes de proteina cristalina de Bacillus thurigiensis secuenciados es actualmente de mas de 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado basado unicamente en la identidad de aminoacidos (Crickmores y otros, [1996], Society for lnvertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, lllrd lnternational Colloquium on Bacillus thurigiensis, Universidad de C6rdoba, C6rdoba, Espara, 1-6 de septiembre de 1996, resumen) . El termino nemotecnico "cr y " se ha conservado para todos los genes de toxina excepto para cytA y cytB que permanecen como clase separada. En la primera fila se han intercambiado los numeros romanos por numeros arabigos y se han eliminado los parentesis en la tercera fila. Se han conservado muchos de los nombres originales con las excepciones indicadas, aunque se han reclasificado algunos.

Se han identificado ahora muchos otros genes de B.t. Los documentos WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137, y Estruch., J.J. y otros (1996) PNAS 93:5389-5393 describen las toxinas Vip1A (a) , Vip1A (b) , Vip2A (a) , Vip2A (b) , Vip3A (a) y Vip3A (b) obtenidas de microbios Bacillus. Se ha indicado que estas toxinas se producen durante el crecimiento celular vegetativo y por ello se denominaron proteinas insecticidas vegetativas (VlP) . Se ha dado cuenta de la actividad de estas toxinas frente a ciertas plagas de lepidopteranos y coleopteranos. El documento WO 98/18932 da a conocer nuevas clases de toxinas plaguicidas.

Entre los obstaculos para el uso exitoso de toxinas de Bacillus figuran el desarrollo de resistencia a las toxinas de B.t. por los insectos. Ademas, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos de las toxinas de Bacillus. Entre ellos figuran insectos tales como picudo del algodonero (Anthonomus grandis) y larva Agrotis, asi como insectos de la mayoria de especies que hasta el momento han demostrado no tener una sensibilidad significativa a las δendotoxinas de B.t. Si bien actualmente tienen gran interes las tecnicas de control de la resistencia en la tecnologia de plantas transgenicas, sigue habiendo una gran necesidad del desarrollo de genes adicionales que se puedan expresar en plantas con el fin de controlar eficazmente... [Seguir leyendo]

1. Una proteina que es activa frente a una plaga de lepidopteranos, que tiene una identidad de como minimo 95% con la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO. 3

5 2. Una proteina de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC lD NO.

3.

3. Un polinucleótido que codifica una proteina de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un polinucleótido de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. lD NO. 2.

5. Una celula microbiana o de planta que comprende un polinucleótido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

10 6. Una celulas de acuerdo con la reivindicación 5, que es una celula bacteriana.

7. Una planta que comprende un polinucleótido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

8. Un procedimiento para controlar una plaga de lepidopteranos, que comprende poner en contacto la plaga con una proteina de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.