Nueva proteasa alcalina de Bacillus SP.(DSM 14392) y detergentes o agentes limpiadores que contienen esta nueva proteasa alcalina.

Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2 .

Nueva proteasa alcalina de Bacillus SP. (DSM 14392) y detergentes o agentes limpiadores que contienen esta nueva proteasa alcalina La presente invención se refiere a una nueva proteasa alcalina del tipo de la subtilisina de Bacillus sp. (DSM 14392) así como a las proteínas suficientemente afines y a sus derivados. Además hace referencia a los detergentes y agentes limpiadores con esta nueva proteasa alcalina del tipo de la Subtilisina, a las proteínas suficientemente afines y a sus derivados, al método correspondiente de lavado y limpieza y a su utilización en los productos de lavado y detergentes así como a otras posibilidades técnicas de empleo.

Las proteasas del tipo de la subtilisina (Subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4.21.62) , en particular las subtilisinas se atribuyen a serina-proteasas debido a la acción catalítica de los aminoácidos. Se han configurado de forma natural a partir de microorganismos, en particular de la especie Bacillus. Actúan como endopeptidasas poco específicas, es decir que hidrolizan cualquier enlace de amida ácida que se encuentra en el interior de péptidos o proteínas. Su pH óptimo se sitúa preferiblemente en una región claramente alcalina. El artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", publicado por R. Bott y C. Betzel, New York 1996 da una ojeada sobre esta familia. Las subtilisinas son adecuadas en una multitud de posibilidades técnicas de aplicación, como componentes de cosméticos y en particular como sustancias activas de detergentes y productos de lavado.

Las enzimas son las sustancias activas de los detergentes y productos de lavado. Las proteasas actúan en el producto o materia de limpieza destruyendo impurezas que contienen proteínas, como por ejemplo en los tejidos o bien superficies duras. En el mejor de los casos se obtienen efectos de sinergia entre las enzimas y los componentes restantes del medio afectado. Por ejemplo, esto queda plasmado en la patente americana 6008178. Entre las proteasas para detergentes las subtilisinas ocupan un lugar preferente por sus propiedades enzimáticas como la estabilidad y el pH óptimo.

De la solicitud de patente internacional WO 9307276 procede, por ejemplo, una proteasa alcalina del tipo elastasa-Yab y su posibilidad de aplicación en los detergentes o productos de limpieza. En la publicación de Kaneko y cols (J. of Bacteriology, Bd. 171, Nr. 9, 1989, páginas 5232-5236) se ha descrito la clonación de la elastasa, el péptido precursor Ya-B de un género Bacillus.

Además en la publicación de Masui y cols (J. of Fermentation and Bioengineering, Bd. 85, Nr. 1, 1998, páginas 3036) se describe la clonación de la serina-proteasa AprN alcalina y al mismo tiempo se publica una comparación de secuencias con otras subtilisinas y serina-proteasas.

Además en la solicitud de patente alemana DE 4411223 se informa sobre el uso de las proteasas de la familia de la subtilisina/elastasa en el procedimiento de lavado o limpieza.

El desarrollo de proteasas en detergentes se basa en las enzimas formadas de forma natural, preferiblemente microbiana. Dichas enzimas se optimizan por medio de un procedimiento conocido de mutagenia, por ejemplo, la mutagenia puntual, la eliminación, inserción o fusión con otras proteínas o partes de proteínas o bien por las diversas modificaciones para su empleo en medios de lavado o detergentes. Los distintos sectores de aplicación técnica requieren proteasas con distintas características, como por ejemplo, en lo referente a las condiciones de reacción, la estabilidad o la especificidad del sustrato. Las posibilidades técnicas de aplicación de las proteasas dependen de otros factores como la estabilidad del enzima a elevadas temperaturas, ante agentes oxidantes, su desnaturalización a causa de los tensoactivos, de los efectos de plegamiento o de sinergias inesperadas con otras sustancias.

Por lo tanto existe una gran necesidad de proteasas que se emplearán en el sector técnico y que debido a la gran diversidad de campos de aplicación deberán tener un espectro amplio de propiedades.

La base de ello se amplía con las nuevas proteasas que se pueden seguir desarrollando para sectores de aplicación muy especializados.

La presente invención tenía el cometido de hallar una proteasa todavía desconocida. La enzima natural o de referencia se debía caracterizar principalmente porque en su empleo en el medio correspondiente debía aproximarse al menos a las enzimas establecidas con esta finalidad. Interesaba una contribución importante en el sector de los detergentes.

Otros cometidos consistían en que debía disponer de ácidos nucléicos que se pudieran codificar para este tipo de proteasas, y disponer también de vectores, células huésped y un método de fabricación que pudieran ser útiles par ala obtención de este tipo de proteasas. Además se debía disponer de los correspondientes medios de limpieza, detergentes, y de los métodos de limpieza pertinentes así como de las posibilidades de aplicación para este tipo de proteasas. Finalmente se tenían que definir las posibilidades técnicas de aplicación para las proteasas halladas.

La resolución del cometido consiste en las proteasas alcalinas del tipo subtilisina, tal como se definen en las reivindicaciones.

Otras soluciones del cometido, o bien soluciones de los cometidos parciales y por tanto objetivos propios de la invención son los ácidos nucléicos, cuyas secuencias son idénticas a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO.1 o bien codifican para las proteasas conforme a la invención, en los correspondientes vectores, células huésped y métodos de fabricación. Además se dispone de los medios correspondientes, de los detergentes, de los procedimientos de lavado correspondientes así como de las correspondientes posibilidades de aplicación para este tipo de proteasas. Finalmente se definen las posibilidades técnicas de aplicación para las proteasas halladas.

Por una proteína se entiende en el sentido de la presente invención un polímero que adquiere una estructura principalmente tridimensional para ejercer su función, configurado linealmente, compuesto de aminoácidos naturales. En la presente invención se identifican los 19 L-aminoácidos de origen natural, proteinógenos con el código de 1 y 3 letras convencional internacional. La combinación de una de estas denominaciones con un número equivaldrá a una proteína correspondiente, cuyo radical aminoácido estará en la correspondiente posición. Para las mutaciones puntuales se establecen identificaciones análogas. Los datos sobre la posición se refieren, mientras no se indique lo contrario, a las formas maduras respectivas de las correspondientes proteínas, es decir sin los péptidos señalizadores (ver a continuación) .

Por una enzima se entiende en el sentido de la presente invención una proteína que ejerce una determinada función bioquímica. Por ejemplo, por enzimas proteolíticas o enzimas con una función proteolítica se entiende en general aquellas enzimas que hidrolizan los enlaces amida de los ácidos de las proteínas, en particular aquellos que se encuentran en el interior de las proteínas y por eso se conocen también como endopeptidasas. Las subtilisinaproteasas son aquellas endopeptidasas que de forma natural están formadas por bacterias gram-positivas y básicamente son segregadas o bien derivan de éstas por métodos biológico-moleculares, y se pueden homologar por trozos, como regiones que tienen una función o forman una estructura con las subtilisina-proteasas naturales. Se conocen como subtilasas. Estas se han mostrado en el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", publicado por R. Bott y C. Betzel, New York 1996. Numerosas proteínas se han formado como las llamadas preproteínas , es decir junto con un péptido señalizador. Se entiende con ello la parte N-terminal de la proteína, cuya función consiste principalmente en la extrusión de la proteína formada de la célula productora en el periplasma o bien en el medio que la rodea y/o garantizar su correcto plegamiento. Seguidamente el péptido señalizador se desprende en condiciones naturales de la proteína restante, de manera que ésta ejerce su propia actividad catalítica sin los aminoácidos N-terminales inicialmente existentes.

Para las aplicaciones técnicas se prefieren los péptidos maduros por su actividad enzimática, es decir las enzimas procesadas tras su fabricación frente a las preproteínas.

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1. Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2

2. Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 106 hasta 374 a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2

3. Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO.1

4. Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO.1 por el segmento parcial que corresponde a las posiciones 106 hasta 374 conforme a la SEQ ID No.2.

5. Proteasa alcalina del tipo de la subtilisina, que se deriva de una proteasa conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 4 por fragmentación o mutagénesis de deleción, con al menos 260 aminoácidos situados dentro de la secuencia de aminoácidos de partida que cuelgan de la molécula de partida.

6. Proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 5, que se caracteriza por que está ramificada por acoplamiento de compuestos de bajo peso molecular, por la reacción química de una cadena lateral, por el enlace covalente de compuestos químicos bifuncionales y/o macromoléculas y/o por la socialización con sustancias concomitantes.

7. Proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 6, que se caracteriza por que adicionalmente está estabilizada, en particular por acoplamiento a un polímero y/o por mutagénesis puntual.

8. Proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 7, que se caracteriza por que se obtiene de una fuente natural, en particular de un microorganismo.

9. Proteína conforme a la reivindicación 8, que se caracteriza por que se trata de una bacteria gram-positiva en el microorganismo.

10. Proteína conforme a la reivindicación 9, que se caracteriza por que la bacteria gram-positiva pertenece a la especie Bacillus.

11. Proteína conforme a la reivindicación 10, que se caracteriza por que en lo referente a la especie Bacillus se trata de la Bacillus sp., en particular la Bacillus sp. (DSM 14392) .

12. Para una proteasa alcalina del tipo de la subtilisina con ácido nucleico codificado, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO.1.

13. Para una proteasa alcalina del tipo de la subtilisina con ácido nucleico codificado, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO.1 por el segmento parcial de las posiciones 316 hasta 1125.

14. Ácido nucleico, que codifica una de las proteínas indicadas en las reivindicaciones 1 hasta 8.

15. Ácido nucleico conforme a una de las reivindicaciones 12 hasta 14, que se caracteriza por que se obtiene de una fuente natural, en particular de un microorganismo.

16. Ácido nucleico conforme a la reivindicación 15, que se caracteriza por que se trata de una bacteria gram-positiva en el microorganismo.

17. Ácido nucleico conforme a la reivindicación 16, que se caracteriza por que se trata de una bacteria gram-positiva de la especie Bacillus.

18. Ácido nucleico conforme a la reivindicación 17, que se caracteriza por que se trata de la Bacillus sp.en particular la Bacillus sp. (DSM 14392) de la especie Bacillus.

19. Vector, que contiene un segmento de ácido nucleico indicado en las reivindicaciones 12 hasta 18, en particular uno que codifica para una proteína indicada en las reivindicaciones 1 hasta 11.

20. Vector de clonación conforme a la reivindicación 19.

21. Vector de expresión conforme a la reivindicación 19.

22. Célula, que contiene un segmento de ácido nucleico indicado en las reivindicaciones 12 hasta 18, en particular uno que codifica para una de las proteínas indicadas en las reivindicaciones 1 hasta 11, preferiblemente sobre un vector conforme a una de las reivindicaciones 19 hasta 21.

23. Célula huésped, que expresa una de las proteínas indicadas en las reivindicaciones 1 hasta 11, o bien puede ser estimulada por su expresión, en particular empleando un segmento de ácido nucleico indicado en una de las reivindicaciones 12 hasta 18, especialmente por el empleo de un vector de expresión conforme a la reivindicación 21.

24. Célula huésped conforme a la reivindicación 23, que se caracteriza por que es una bacteria, en particular una que segrega la proteína formada al medio que la rodea.

25. Bacteria conforme a la reivindicación 24, que se caracteriza por que es una bacteria gram-positiva, en particular de una especie Bacillus, especialmente de la especie, Bacillus lentus Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

26. Célula conforme a la reivindicación 22 ó 23, que se caracteriza por que es una célula eucariótica, en particular una que modifica la proteína formada postranslacionalmente.

27. Método para la fabricación de una de las proteínas indicadas en las reivindicaciones 1 hasta 11 empleando un ácido nucleico conforme a una de las reivindicaciones 12 hasta 18 y/o empleando un vector conforme a una de las reivindicaciones 19 hasta 21 y/o empleando una célula conforme a una de las reivindicaciones 22 hasta 26.

28. Medio, que se caracteriza por que contiene una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11.

29. Detergente o medio de lavado, que se caracteriza por que contiene una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11.

30. Medio conforme a la reivindicación 29, que se caracteriza por que la proteína se encuentra en una cantidad de 2 μg hasta 160 mg, preferiblemente de 5 μg hasta 140 mg, en particular de 20 μg hasta 120 mg, muy especialmente de 50 μg hasta 80 mg por g de medio.

31. Medio conforme a la reivindicación 29 ó 30, que se caracteriza por que la contiene además otras enzimas, en particular otras proteasas, amilasas, celulasas, hemicelulasas, oxidoreductasas y/o lípidos.

32. Medio para el tratamiento de material textil o para el cuidado de tejidos, que se caracteriza por que solo o con otras sustancias activas contiene una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11, en particular para fibras o tejidos con componentes naturales y muy especialmente para los que tienen lana o seda.

33. Método para la limpieza mecánica de tejidos o bien superficies duras, que se caracteriza por que en al menos una de las etapas del proceso una proteína es activa conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11, en particular en una cantidad de 40 μg hasta 32 g, preferiblemente de 50 μg hasta 24 g, en particular de 100 μg hasta 16 g, muy especialmente de 200 μg hasta 8 g por aplicación.

34. Método para el tratamiento de material textil o para el cuidado de tejidos, que se caracteriza por que al menos en una de las etapas del proceso, una proteína es activa conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11, en particular para fibras o tejidos con componentes naturales y muy especialmente para los que tienen lana o seda.

35. Utilización de una proteína activa proteolíticamente conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para la limpieza de tejidos o superficies duras, en particular en una cantidad de 40 μg hasta 32 g, preferiblemente de 50 μg hasta 24 g, en particular de 100 μg hasta 16 g, y muy especialmente de 200 μg hasta 8 g por aplicación.

36. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para la activación o desactivación de sustancias de los detergentes o medios de lavado.

37. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para el análisis bioquímico o para la síntesis de compuestos de bajo peso molecular o de proteínas.

38. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para la preparación, limpieza o síntesis de sustancias naturales o sustancias biológicas.

39. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para el tratamiento de materias primas naturales, en particular para el tratamiento de superficies, en especial en un método para el tratamiento de cuero.

40. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para la obtención o el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricación de tejidos, en especial para eliminar capas de suciedad de los tejidos.

41. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de tejidos, en particular para el tratamiento de lana o seda o tejidos mixtos que contienen lana o seda.

42. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para el tratamiento de películas fotográficas, en particular para la eliminación de capas de suciedad que contienen gelatina o sustancias similares.

43. Utilización de una proteína conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para la fabricación de alimentos o pienso.