Nitrilo hidratasas tolerantes al cianuro.

Polinucleótidos aislados, que codifican unos polipéptidos con las secuencias de aminoácidos,

que son idénticas en un 97 hasta un 100 % a las secuencias de aminoácidos, que están contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 o 3, poseyendo los polipéptidos la actividad de una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro.

Nitrilo hidratasas tolerantes al cianuro.

El invento se refiere a nitrilo hidratasas tolerantes al cianuro, que proceden en particular de cepas de Pseudomonas putida o Pseudomonas marginalis, y que tienen una tolerancia aumentada al cianuro, a su utilización para la preparación de amidas a partir de nitrilos en presencia de cianuros y a unas secuencias de polinucleótidos que codifican esta enzima.

La reacción de a-hidroxinitrilos (cianhidrinas) y de a-aminonitrilos para dar las correspondientes amidas mediante nitrilo hidratasas abre una nueva variante de síntesis para dar a-hidroxiácidos y a-aminoácidos, puesto que las ahidroxi- y a-amino-amidas pueden ser saponificadas de un modo sencillo (Process and catalysts for the production of methionine [Procedimiento y catalizadores para la producción de metionina]. Ponceblanc, Herve; Rossi, Jean-Christophe; Laval, Philip; Gros, Georges. (Rhone-Poulenc Animal Nutrition SA, Fr.) , (documento de solicitud de patente internacional WO 2001060789) . Alternativamente, las a-hidroxiamidas pueden ser hechas reaccionar también con hidróxidos de metales alcalinos o alcalino-térreos para dar las correspondientes sales de los hidroxiácidos. En este contexto se prefiere especialmente la reacción de la 4-metiltio-a-hidroxibutiramida (amida de MHA) con el hidróxido de calcio, puesto que la sal de calcio de MHA se puede emplear como aditivo para piensos directamente como una forma alternativa de producto con respecto a la metionina o el MHA.

No obstante, los a-hidroxinitrilos y a-aminonitrilos se descomponen fácilmente para dar aldehídos y ácido cianhídrico o respectivamente aldehídos, ácido cianhídrico y amoníaco. El ácido cianhídrico resultante es un fuerte agente inhibidor para casi todas las nitrilo hidratasas conocidas, con la excepción de la nitrilo hidratasa prcedente de Rhodococcus equi XL-1, que en el caso de una concentración 20 mM de cianuro muestra la más pequeña pérdida de actividad que se conoce hasta ahora. (Production of amides from nitriles by Rhodococcus equi cells having a cyanide resistant-nitrile hydratase. [Producción de amidas a partir de nitrilos por células de Rhodococcus equi que tienen una nitrilo hidratasa resistente al cianuro] Nagasawa, Tohru; Matsuyama, Akinobu. (Daicel Chemical Industries, Ltd., Japón) , (documento de solicitud de patente europea EP 1 266 962 A) .

La pequeña productividad del producto, de aproximadamente 8 g de la amida por g de biomasa seca de las células en reposo, el largo período de tiempo de reacción de 43 horas, y la concentración relativamente pequeña del producto de 75 g/l conducen a la búsqueda de unas nitrilo hidratasas mejoradas.

El objetivo del invento aquí descrito consiste, por lo tanto, en poner a disposición un biocatalizador, que no esté sujeto a estas limitaciones. Además de esto, es ventajosa una tolerancia todavía más alta del biocatalizador frente al cianuro, puesto que los a-hidroxinitrilos y los a-aminonitrilos se `preparan, para garantizar una conversión química rápida y completa del aldehído, de manera preferida con un exceso de 1-3 % del ácido cianhídrico, que permanece parcialmente en el producto. Por consiguiente, durante la biotransformación pueden aparecer unas concentraciones del cianuro que sobrepasan los 20 mM. Los productos secundarios y los reactivos, tales como unas aminas empleadas como bases auxiliares, no deben de inhibir tampoco a la actividad de la nitrilo hidratasa.

La misión del invento consiste en poner a disposición unas nitrilo hidratasas, que tengan una estabilidad aumentada frente a los iones de cianuro presentes en la solución de reacción al realizar la conversión química de nitrilos en amidas.

Son objeto del invento unos polinucleótidos aislados, procedentes de microorganismos del género Pseudomonas, que codifican unos polipéptidos con las secuencias de aminoácidos, que son idénticas en un 97 % hasta un 100 % a las secuencias de aminoácidos que están contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 o 3, poseyendo los polipéptidos, que contienen las secuencias SEQ ID NO:2 o 3, en común en cada caso la actividad de una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro, o respectivamente formando ellos esta nitrilo hidratasa.

Los polinucleótidos proceden de Pseudomonas marginalis.

Además, constituyen un objeto del invento unos polinucleótidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de a) unos polinucleótidos, que contienen la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o unas secuencias de nucleótidos complementarias con ella, b) unos polinucleótidos, que contienen unas secuencias de nucleótidos, que corresponden a las secuencias procedentes de a) dentro del marco de la degeneración del código genético, c) unos polinucleótidos, que contienen unas secuencias de nucleótidos de acuerdo con a) , que contienen unas mutaciones con sentido neutras en su funcíón, d) unos polinucleótidos, que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias procedentes de a) o c) , codificando los polinucleótidos una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro.

Asimismo, son objeto del invento los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos con las secuencias SEQ ID NO:2 o 3, que tienen la actividad de unas nitrilo hidratasas tolerantes al cianuro, procedentes de microorganismos del género Pseudomonas, que tanto se pueden enriquecer en los microorganismos o se pueden presentar en una forma aislada. La SEQ ID NO:2 codifica la subunidad alfa de la nitrilo hidratasa, la SEQ ID NO:3 codifica la subunidad beta de la nitrilo hidratasa, y las SEQ ID NO:5 y 10 codifican unas proteínas activadoras, cuya expresión concomitante es esencial para la actividad de las nitrilo hidratasas (Nojiri y colaboradores, 1999, Journal of Biochemistr y , 125:696-704) .

Conforme al invento, se utilizan unas células anfitrionas, que habían sido transformadas o transfectadas por medio de los polinucleótidos conformes al invento.

Las células anfitrionas pueden contarse entre los eucariotas o procariotas, para los que se conoce un sistema estable de expresión, en particular Como organismo anfitrión sirven de manera preferida los microorganismos, para los que existen sistemas de expresión, tales como p.ej. Pseudomonas, Pichia, diversas levaduras, Saccharomyces, Aspergillus, o de la familia de Streptomyces, en particular E. coli. Asimismo se adecuan unos microorganismos del género Rhodococcus.

El ADN de vector se puede introducir en células eucariótícas o procariótícas mediante unas técnicas conocidas de transformación o transfección.

Los ´conceptos de "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" se refieren a unas medidas técnicas conocidas a partir del estado de la técnica, con el fin de introducir un ADN ajeno.

Son objeto de la descripción asimismo unos polinucleótidos, que se componen en lo esencial de una secuencia de polinucleótidos, y que son obtenibles por escrutinio mediante una hibridación de un correspondiente banco genómico de Pseudomonas marginalis, que contiene el gen completo o partes de éste, con una sonda, que contiene las secuencias de los polinucleótidos conformes al invento procedentes de las SEQ ID NO:1, 4 o 6, 9, o unos fragmentos de éstas, y el aislamiento de la mencionada secuencia de polinucleótidos.

Los polinucleótidos, que contienen las secuencias de acuerdo con la descripción, son adecuados como sondas de hibridación para un ARN, un ADNc (cromosomal) y un ADN, con el fin de aislar unos ácidos nucleicos o respectivamente unos polinucleótidos o unos genes en su plena longitud, que codifican las proteínas conformes al invento, o con el fin de aislar aquellos ácidos nucleicos o respectivamente polinucleótidos o genes, que tienen una alta similaridad de las secuencias con las de los genes conformes al invento. Ellos se pueden aplicar asimismo como una sonda sobre unos denominados conjuntos (en inglés "arrays") , micro conjuntos (en inglés "micro arrays") o chips de ADN (en inglés "DNA chips") , con el fin de detectar y determinar los correspondientes polinucleótidos o unas secuencias derivadas de éstos, tales como p.ej. un ARN o un ADNc.

Los polinucleótidos, que contienen las secuencias de acuerdo con la descripción, son adecuados además como cebadores, con cuya ayuda, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR acrónimo de Polymerase Chain Reaction) se puede producir un ADN de genes, que codifican las proteínas conformes al invento.

Aquellos oligonucleótidos, que sirven como sondas o cebadores,... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótidos aislados, que codifican unos polipéptidos con las secuencias de aminoácidos, que son idénticas en un 97 hasta un 100 % a las secuencias de aminoácidos, que están contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 o 3, poseyendo los polipéptidos la actividad de una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro.

2. Polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) unos polinucleótidos, que contienen la SEQ ID NO:1 o unas secuencias de nucleótidos complementarias con ella, b) unos polinucleótidos, que contienen unas secuencias de nucleótidos, que corresponden a las secuencias procedentes de a) dentro del marco de la degeneración del código genético, c) unos polinucleótidos, que contienen unas secuencias de nucleótidos de acuerdo con a) , que contienen mutaciones con sentido neutras en su función, d) unos polinucleótidos, que se hibridan con las secuencias complementarias procedentes de a) en condiciones rigurosas, entendiéndose por el concepto de "condiciones rigurosas" el lavado en 0, 1x SSC a una temperatura de 50 a 68°C, codificando los polinucleótidos una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro.

3. Polipéptidos, que contienen unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en un 97 % hasta un 100 % a las secuencias SEQ ID NO:2 o 3.

4. Polipéptidos con la actividad de una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro de acuerdo con la reivindicación 3, cuya actividad restante después de la conversión química de metacrilonitrilo en presencia de 20 mM (mM = mmol/l) de iones de cianuro a 20°C, después de 30 min, es de por lo menos un 90 % de la actividad restante de la misma enzima, cuando ésta se había empleado para la reacción en unas condiciones por lo demás idénticas en ausencia de iones de cianuro.

5. Vectores, que contienen un polinucleótido, que se escoge entre los de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. Célula anfitriona, transformada o transfectada mediante la introducción de un polinucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Célula anfitriona, transformada mediante la introducción de un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Procedimiento para la preparación enzimática de amidas a partir de nitrilos, que tiene las siguientes etapas: a) conversión química de un compuesto que contiene grupos nitrilo con una enzima microbiana (un polipéptido) de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene la actividad de una nitrilo hidratasa y b) separación de la amida formada,

realizándose que para la conversión química del nitrilo en la amida se emplea una nitrilo hidratasa tolerante al cianuro de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se emplean unos microorganismos, que producen y contienen la mencionada enzima, de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7 o un material lisado de éstos.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque se emplean células en reposo del microorganismo.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se emplea una nitrilo hidratasa purificada.

12. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 11, caracterizado porque la enzima procede de unos microorganismos de la especie Pseudomonas marginalis.

13. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 8 hasta 11, caracterizado porque la enzima procede de unos microorganismos empleados de la especie Pseudomonas marginalis.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque los microorganismos empleados se han presentado bajo el número DSM 16276.

15. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 14, caracterizado porque se hacen reaccionar los compuestos de las fórmulas generales

en las que significan:

X: OH, H, alquilo, NH2;

R: H, un radical alquilo saturado con 1 a 12 átomos de C, ramificado o sin ramificar, eventualmente sustituido con NH2, radicales alquilo insaturados, que tienen un enlace doble y 1 a 12 átomos de C, ramificados o sin ramificar, grupos cicloalquilo con 3 a 6 átomos de C, radicales alquileno sustituidos con grupos alquiltio, correspondiendo en este caso el alquilo a un radical de C1 a C3 y el alquileno a un radical divalente de C3 a C8, R': H, alquilo con 1 a 3 átomos de C, R'': un anillo insaturado de uno o dos núcleos con 6 a 12 átomos de C, eventualmente sustituido con uno o dos grupos alquilo de C1-C3, Cl, Br o F, un radical alquil-nitrilo con 1 a 6 átomos de C para formar las correspondientes amidas.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque se hace reaccionar un compuesto de la fórmula general (I) en presencia de ácido cianhídrico o de una sal del ácido cianhídrico.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en presencia de una concentración inicial de desde más que 0, 5 % en moles de cianuro hasta de 3 % en moles de cianuro, referida al nitrilo empleado.

18. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 17, caracterizado porque como nitrilo se emplea el 2-amino-4-metiltio-butironitrilo.

19. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 17, caracterizado porque como nitrilo se emplea el 2-hidroxi-4-metiltio-butironitrilo, que eventualmente está contenido en la mezcla de reacción procedente de la preparación de este nitrilo.

20. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 17, caracterizado porque como nitrilo se emplea el 2-hidroxi-2-metil-propionitrilo.

21. Microorganismos del género Pseudomonas, presentados bajo el número DSM 16276.

22. Nitrilo hidratasas tolerantes al cianuro, aisladas a partir de las cepas del género Pseudomonas, presentadas bajo el número DSM 16276.

Figura 1 MA32

Figura 2 MA113

Figura 3 MA31

Figura 4 MA113

Figura 5 MA113

Figura 6 MA32

Figura 7