Una nanoemulsión de perfluorocarbono estable que tiene una superficie potenciadora de endocitosis,

teniendodicha nanoemulsión una fase de perfluorocarbono continua y una fase acuosa discontinua tamponada y quecomprende

(a) un componente de perfluorocarbono que comprende al menos un compuesto de perfluorocarbono;

(b) un componente emulsificante; y

(c) transferrina o un derivado de la misma como un componente potenciador de endocitosis que inducecaptación celular de la nanoemulsión a través de endocitosis.

Nanoemulsiones de perfluorocarbono con superficie de potenciación de endocitosis para transferencia génica

La presente invención proporciona nanoemulsiones de perfluorocarbono estables que son adecuadas para transferencia génica, su producción y uso.

Introducción

Los oligonucleótidos convencionales y más recientemente ARN de interferencia cortos son materiales prometedores y ampliamente usados para transferencia génica. Hasta ahora, las posibilidades para aplicar este material genético a un animal vivo estaban muy limitas.

Para la administración de material genético, las emulsiones de perfluorocarbono (PFC) son una herramienta prometedora, ya que estas emulsiones se usan de forma satisfactoria como transportadores de oxígeno (Daugherty,

W. P., y col., Neurosurger y 54: 1223-1230 (2004) ; Riess, J. G., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 33: 4763 (2005) ) . A continuación de la aplicación intratecal, las emulsiones de perfluorocarbono convencionales pueden transportar fármacos al pulmón (Dickson, E. W. y col., Acad. Emerg. Med 10: 1019-1023 (2003) ) . Además, las emulsiones de PFC tienen la ventaja de una eliminación segura mediante exhalación (Putyatina, T. K. y col., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 22: 1281-1285 (1994) ) .

Por lo tanto, los perfluorocarbonos podrían funcionar como una herramienta eficaz y segura para la administración de un material genético a un animal vivo. Debido a su función como transportadores de oxígeno las emulsiones de PFC convencionales tienen tamaños que evitan que salgan del lecho vascular y por lo tanto tales emulsiones no serían capaces de transportar sustancias a células de un organismo vivo.

En los últimos años se han presentado varios sistemas de transporte menos eficaces, por ejemplo, transporte unido a colesterol o mediado por apolipoproteína A en el hígado (Kim, S. I. y col., A-I. Mol Ther. 15: 1145-1152 (2007) ) .

El documento EP-B-0788347 divulga la producción de emulsión de fluorocarbono de agua-en-aceite que contiene gotas acuosas de un diámetro promedio de hasta 10 nm. Un agente tensioactivo fluorado o una mezcla de agentes tensioactivos que contienen al menos un agente tensioactivo fluorado se utiliza como un agente emulsificante.

El documento EP-A-1844772 divulga una composición para transfección de células con oligonucleótidos en la que el agente emulsificante es un derivado de imidazolio que tiene cadenas de hidrocarburo o fluorocarburo C10-C36.

El documento EP-B-00831770 divulga una microdispersión continua de compuestos fluorados que contiene una fase discontinua que porta el compuesto farmacéuticamente activo. El documento US 2004/0115159 divulga una nanoemulsión de aceite-en-agua que consiste en un sistema ternario de sustancias tensioactivas que es adecuado como un agente de transporte para cosméticos y agentes farmacéuticos. Este sistema ternario comprende un tensioactivo aniónico, uno catiónico y uno anfifílico.

El documento US 7.211.248 divulga procedimientos de transfección de células hepáticas con ADN en los que un agente de contraste ultrasónico se complementa con una micropartícula estabilizadora de proteína que porta ADN de plasma. La transfección se logra mediante ultrasonicación de células hepáticas.

El documento US 2007/0184076 divulga una mezcla de nanogotas que consiste en una mezcla oleosa biológicamente aceptable de fluorocarburos y una sustancia terapéuticamente activa, por ejemplo, un agente anticáncer.

El documento US 2006/0013820 divulga una composición que comprende diversos fluorocarburos, un antígeno que es adecuado como agente terapéutico y opcionalmente vehículos farmacéuticos adicionales. La composición se dice que es adecuada como una vacuna especialmente para tratar VIH.

Los documentos WO 96/40057, WO 96/40053 y EP-A-1306083 divulgan (nano) emulsiones de perfluorocarbono estables como vehículos para sustancias terapéuticamente activas.

El documento US 6.071.890 divulga sustancias catiónicas anfifílicas que soportan el transporte de ADN y ARN y compuestos biológicamente activos adicionales dentro del organismo. Estas sustancias están acopladas a esteroides.

El documento WO 01/722812 divulga una micropartícula que comprende un material polimérico, un factor terapéutico biológicamente activo y proteínas lipídicas como agentes de transfección.

Aún se requiere un vehículo de transporte fiable para transferencia génica en un organismo.

Sumario de la invención

Ahora se ha observado que una nanoemulsión de perfluorocarbono, en particular una nanoemulsión de perfluorocarbono que tiene fosfolípidos como agentes emulsificantes, que tiene una superficie potenciadora de endocitosis es adecuada para la aplicación de material genético in vivo. La adición de moléculas que proporcionan una superficie potenciadora de endocitosis a la nanoemulsión aumenta significativamente la captación de la nanoemulsión de perfluorocarbono en las células. La invención proporciona por tanto

(1) una nanoemulsión de perfluorcarbono estable que tiene una superficie potenciadora de endocitosis, teniendo dicha nanoemulsión una fase de perfluorocarbono continua y una fase acuosa discontinua tamponada y que comprende

(a) un componente de perfluorocarbono que comprende al menos un compuesto de perfluorocarbono;

(b) un componente emulsificante; y

(c) transferrina o un derivado de la misma como un componente de potenciador de endocitosis que induce captación celular de la nanoemulsión a través de endocitosis;

(2) una realización preferida de (1) anteriormente, en la que dicho compuesto potenciador de endocitosis es transferrina;

(3) un agente de transferencia génica o una composición farmacéutica que comprende la nanoemulsión como se define en (1) o (2) anteriormente,

(4) un procedimiento para preparar la nanoemulsión de (1) o (2) anteriormente o el agente de transferencia génica o composición farmacéutica de (3) anteriormente, que comprende las siguientes etapas

(a) preparar una solución acuosa tamponada que contiene el componente emulsificante,

(b) añadir el componente de perfluorocarbono, y

(c) mezclar y homogeneizar mediante un homogeneizador de alta presión el producto de reacción de la etapa (b) ;

(5) el uso de una nanoemulsión como se define en (1) o (2) anteriormente para preparar un medicamento para transferir material genético a un paciente; y

(6) un procedimiento para transferir compuestos hidrófilos a células in vitro, que comprende poner en contacto las células con una nanoemulsión como se define en (1) o (2) anteriormente o con el agente de transferencia génica como se define en (3) anteriormente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el perfil de temperatura de la unidad de calentamiento y la temperatura corporal media con desviación típica de cinco ratones anestesiados. La Figura 2 muestra la presión arterial media con desviación típica de cinco ratones anestesiados durante la secuencia de enfriamiento (control) . La Figura 3 muestra la presión arterial media (± DT) 6-7 horas después de la aplicación del bloqueante ACE Captopril (n = 5, 10 mg/kg de Captopril) , puntos grises = valores de control, puntos negros = valores reales) . La Figura 4 muestra la presión arterial media (± DT) 24 horas después de la aplicación del nanotransportador con ARNic de angiotensinógeno (n = 5, 300 μl nanotransportador, 60 μg de ARNic de Agt, superficie: transferrina protegida por Fortecortin) , puntos grises = valores de control, puntos negros = valores reales. La Figura 5 muestra la presión arterial media (± DT) 24 horas después de la aplicación de ARNic de angiotensinógeno (n = 5, 60 μg ARNic de Agt) sin nanotransportador inyectado a los dos segundos “Transfección hidrodinámica”, puntos grises = valores de control, puntos negros = valores reales. La Figura 6 muestra la presión arterial media (± DT) 24 horas después de la aplicación del ARNic de angiotensinógeno usando un nanotransportador incompleto, la superficie del nanotransportador está... [Seguir leyendo]

1. Una nanoemulsión de perfluorocarbono estable que tiene una superficie potenciadora de endocitosis, teniendo dicha nanoemulsión una fase de perfluorocarbono continua y una fase acuosa discontinua tamponada y que comprende

(a) un componente de perfluorocarbono que comprende al menos un compuesto de perfluorocarbono;

(b) un componente emulsificante; y

(c) transferrina o un derivado de la misma como un componente potenciador de endocitosis que induce captación celular de la nanoemulsión a través de endocitosis.

2. La nanoemulsión de la reivindicación 1 en la que

(i) La nanoemulsión tiene un tamaño de partícula por debajo de 100 nm, preferentemente la nanoemulsión consiste en partículas que tienen el tamaño promedio de aproximadamente 50 nm;

(ii) dicha fase acuosa tamponada representa del 25 al 60% en peso de la nanoemulsión; y/o

(iii) el componente potenciador de endocitosis es transferrina.

3. La nanoemulsión de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho al menos un compuesto de perfluorocarbono se selecciona entre CmF2m+1X, XCmF2mX, XCnF2nOCoF2ºX, N (CoF2ºX) 3 y N (CoF2º+1) 3 (en la que m es un número entero de 3 a 10, n y o son números enteros de 1 a 5 y X se selecciona independientemente de aparición adicional entre Cl, Br e I) , preferentemente el perfluorcarbono se selecciona entre perfluoroocitlbromuro y perfluorotributilamina y mezclas de los mismos.

4. La nanoemulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho componente emulsificante comprende al menos un fosfolípido como el componente emulsificante esencial y uno o más lípidos auxiliares.

5. La nanoemulsión de la reivindicación 4, en la que dicho al menos un fosfolípido se selecciona entre compuestos representados por la fórmula I

en la que R1 y R2 se seleccionan independiente entre H y restos de acilo C16-24, que pueden estar saturados o insaturados y pueden portar 1 a 3 restos R3 y en la que uno o más de los átomos C se pueden ser sustituidos por O

o NR4, y X se selecciona entre H, - (CH2) p-N (R4) 3+, - (CH2) p-CH (N (R4) 3+) -COO-, - (CH2) p-CH (OH) -CH2OH y CH2 (CHOH) p-CH2OH (en la que p es un número entero de 1 a 5; R3 se selecciona independientemente entre H, alquilo inferior, F, Cl, CN y OH; y R4 se selecciona independiente entre H, CH3 y CH2CH3) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, preferentemente R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y restos acilo C16-24 no sustituidos, que pueden estar saturados o insaturados y X se selecciona entre un resto de colina, serina, etanolamina e inositol.

6. La nanoemulsión de la reivindicación 5, en la que el componente de fosfolípido se selecciona entre fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y mezclas de los mismos.

7. La nanoemulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que el lípido auxiliar se selecciona entre ácidos grasos, esteroides, vitaminas y mezclas de los mismos.

8. La nanoemulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende perfluoroocitlbromuro como componente de perfluorocarbono (a) , un componente emulsificante (b) que comprende fosfatidilcolina, esfingomielina, colesterol y lisofosfatidilcolina, como fosfolípido y transferrina como el componente potenciador de endocitosis (c) .

9. La nanoemulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es adecuada para transferencia de compuestos hidrófilos, incluyendo agentes farmacéuticos y material genético, a células in vivo e in vitro, preferentemente la nanoemulsión es adecuada para transferencia de material genético seleccionado entre secuencias de ARN y ADN y combinaciones y derivados de las mismas, más preferentemente para transferencia de ARNmi, ARNic o ARNbc.

10. Un agente de transferencia génica o una composición farmacéutica que comprende una nanoemulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El agente de transferencia génica o una composición farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende además agentes farmacéuticos y material genético a ser transferirido a células in vivo e in vitro, preferentemente el

agente de transferencia génica o composición farmacéutica comprende material genético seleccionado entre secuencias de ARN y ADN y combinaciones y derivados de las mismas más preferentemente comprende ARNmi, ARNic o ARNbc.

12. Un procedimiento para preparar la nanoemulsión de las reivindicaciones 1 a 9 y el agente de transferencia 5 génica o composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11, procedimiento que comprende las siguientes etapas

(a) preparar una solución acuosa tamponada que contiene el componente emulsificante,

(b) añadir el componente de perfluorocarbono y

(c) mezcla, homogeneización de presión alta posterior del producto de reacción de etapa (b) .

13. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende además

(d) añadir el componente potenciador de endocitosis y/o el compuesto hidrófilo para transferencia al producto de reacción de la etapa (c) y homogeneizar la mezcla resultante.

14. Un procedimiento para transferir compuestos hidrófilos a células in vitro, que comprende poner en contacto las células con una nanoemulsión de las reivindicaciones 1 a 9 o con un agente de transferencia génica de la reivindicación 10 u 11.

15. Uso de una nanoemulsión de las reivindicaciones 1 a 9 para preparar un medicamento para transferir agentes farmacéuticos y material genético a un paciente.