Mutantes de la ADN polimerasa MU.

Se describen mutantes de la ADN polimerasa mu (Pol{mu}) que presentan una mayor actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal que la enzima silvestre (wt) y mejoran su potencialidad como herramienta molecular.

Dichos mutantes pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en técnicas de marcaje de polinucleótidos o de reunión de extremos protuberantes y romos.

Mutantes de la ADN polimerasa mu.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de mutantes de la ADN polimerasa mu humana (Polμ) y a los usos de los mismos. Estos mutantes presentan características mejoradas respecto a la versión silvestre de dicha polimerasa que mejoran su potencialidad como herramienta molecular.

Antecedentes de la invención

La estabilidad de la información genética no sólo depende de la fiabilidad de los sistemas de replicación sino también de la existencia de múltiples sistemas de reparación, que corrigen la mayoría de los tipos de daños que se producen en el ADN. Además de estos sistemas de reparación, es evidente la existencia de reacciones enzimáticas alternativas que de algún modo contrarrestan los efectos de los primeros, generando variabilidad en el ADN. Una de las enzimas implicadas en este tipo de procesos es la desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT) involucrada en los procesos de generación de diversidad y que selectivamente actúa sobre aquellos genes codificantes de receptores de antígenos (Komori et al. (1993). Science, 261, 1171-1175).

La TdT es una enzima de 58 kDa que normalmente sólo se encuentra presente en linfocitos B y T inmaduros. Esta enzima cataliza la adición de desoxinucleótidos en el extremo 3'OH terminal de las cadenas de oligonucleótidos sin necesidad de una hebra de ADN molde (actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal), generando así diversidad en los receptores de antígenos de las referidas células de defensa del sistema inmune. Esta actividad de TdT ha permitido que esta polimerasa haya sido ampliamente utilizada como herramienta molecular, especialmente, en técnicas de mareaje de ADN.

Una de estas técnicas de mareaje es el ensayo TUNEL que se basa en el principio de que la TdT incorpora desoxiuridina marcada (e.g. dUTP-biotina) en los extremos 3'OH de roturas de cadenas dobles y simples del ADN. La incorporación de dUTP marcada actúa como una señal que puede ser detectada fácilmente, por ejemplo, a través de técnicas de fluorescencia. Cuantas más roturas tenga el ADN mayor será la señal resultante. Esta técnica permite, entre otras aplicaciones, identificar muestras que están sufriendo procesos apoptóticos o medir la calidad de una muestra biológica.

Desde el descubrimiento de la TdT, han sido pocas las enzimas con actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal encontradas en la naturaleza y, actualmente, ésta es la única que se comercializa a gran escala (e.g. Roche Applied Science, Promega, Invitrogen).

En el año 2000, una nueva polimerasa con actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal y perteneciente a la familia X de las ADN polimerasas, la polimerasa mu (Polμ), fue identificada y secuenciada por primera vez (Domínguez et al, (2000) Embo J, 19, 1731-1742). Sin embargo, aunque se puede decir que existe una amplia similitud estructural entre Polμ y TdT, la actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal de esta nueva enzima es comparativamente muy inferior a la de la TdT. Este hecho ha imposibilitado su incorporación al mercado como una alternativa viable a la TdT, siendo todavía necesario el descubrimiento o desarrollo de nuevas enzimas que presenten esta actividad mejorada o incrementada. Hasta la fecha, únicamente el mutante simple de Polμ humana, R387K, presenta una actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal superior a la polimerasa silvestre y similar a la de la TdT (María José Martín et al. Gordon Research Conference on Mutagenesis 07/20/2008 - 07/25/2008 at Magdalen College in Oxford. "Rate limited terminal transferase activity of human Pol μ: contribution to imprecise end-joining of non-complementary ends").

Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado mutantes de Polμ que presentan una mayor actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal que la enzima silvestre o wildtype (Polμ wt: UniProtKB/Swiss-Prot Q9NP87: SEQ ID NO: 17) e incluso que la propia TdT. Concretamente, la invención proporciona varios mutantes de Polμ con una elevada actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal, superior a la de la Polμ wt, que pueden ser empleados, entre otras, en técnicas de mareaje de polinucleótidos o de reunión de extremos protuberantes y romos (End joining).

Así, en un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan mutantes de Polμ (en adelante, mutantes de la invención) que tienen al menos alrededor de un 10% más de actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal que la Polμ wt, preferentemente la Polμ humana. Preferentemente, dicha actividad es al menos alrededor de un 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% superior a la de la Polμ wt. Del mismo modo, los mutantes de la invención también tienen una actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal igual o superior a la del mutante R387K (en adelante, también referido como mutante R), preferentemente dicha actividad es al menos alrededor de un 10% superior y, más preferentemente, al menos alrededor de un 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300% superior. Estos mutantes en combinación o individualmente son susceptibles de ser empleados como herramientas moleculares, preferentemente, en cualquiera de las técnicas en que se utiliza la TdT, bien como sustitutivos de ésta o en combinación con la misma.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona una secuencia polinucleotídica (en adelante, secuencia polinucleotídica o polinucleótido de la invención) que codifica- cualquiera de los mutantes de la invención. Del mismo modo, también forman de parte de la invención cualquier: i) vector que comprenda al polinucleótido de la invención o ii) célula huésped que comprenda la secuencia polinucleotídica de la invención o un vector de acuerdo con la invención.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de los mutantes de la invención que preferentemente comprende: i) el cultivo de una célula huésped de acuerdo con la invención y ii) el aislamiento del mutante producido.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al empleo de los mutantes de la invención como herramienta molecular, preferentemente, en todas aquellas técnicas donde participa la TdT, bien como sustitutivos de ésta o en combinación con la misma. Más concretamente, los mutantes de la invención en combinación o individualmente son susceptibles de ser empleados en ensayos de: i) mareaje de extremos de polinucleótidos de cadena simple (heteropolímeros u homopolímeros) y cadena doble (extremos protuberantes o romos), ii) reunión de extremos protuberantes y romos, iii) polimerización dependiente o independiente de molde, iv) rellenado de gaps o huecos (gap-filling), v) detección de roturas de ADN (mismatch detection; e.g. TUNEL), vi) mutagénesis o generación de variabilidad, etc.

Un quinto aspecto de la invención proporciona kits que comprenden cualquiera de los mutantes de la invención, preferentemente, para llevar a cabo cualquiera de los ensayos referidos en el párrafo anterior. Adicionalmente, además de los componentes necesarios para poner en marcha el correspondiente ensayo (e.g. tampones, cebadores, dNTPs, ddNTPs, marcadores, etc.), los kits pueden comprender TdT o mutantes de la misma. El empleo de dichos kits para las aplicaciones previamente mencionadas, por ejemplo, en ensayos de: i) mareaje de extremos de polinucleótidos de cadena simple (heteropolímeros u homopolímeros) y cadena doble (extremos protuberantes o romos), ii) reunión de extremos protuberantes y romos, iii) polimerización dependiente o independiente de molde, iv) rellenado de gaps o huecos (gap-filling), v) detección de roturas de ADN (mismatch detection; e.g. TUNEL), vi) mutagénesis o generación de variabilidad, etc., constituye un aspecto adicional de esta invención.

Definiciones

El término "actividad deoxinucleotidil-transferasa terminal" o "actividad transferasa terminal" se define como la capacidad de llevar a cabo reacciones de polimerización independiente de molde, añadiendo nucleótidos a un extremo 3'OH sin ser éstos seleccionados por ningún criterio de complementariedad de bases. Esta actividad puede ser medida mediante diferentes ensayos sobre diferentes tipos de sustratos, preferentemente, sobre ADN de cadena simple homopoliméricas (ver Ejemplos 1 y 3). A lo largo de la descripción, cuando se indica que esta actividad se encuentra incrementada... [Seguir leyendo]

1. ADN polimerasa mu (Polμ) mutada que presenta una actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal al menos alrededor de un 10% superior a la actividad desoxinucleotidil-transferasa terminal de la ADN polimerasa mu mutada R387K.

2. ADN polimerasa mu mutada según la reivindicación 1, que comprende al menos dos mutaciones.

3. ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende una secuencia con al menos un 60% de identidad con la SEQ ID NO: 17, o con cualquiera de sus subsecuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o con un fragmento de cualquiera de dichas secuencias que mantiene la actividad transferasa terminal incrementada o sustancialmente incrementada.

4. ADN polimerasa mu mutada según la reivindicación 3, que comprende al menos dos mutaciones que consisten en (i) una primera mutación puntual en la posición 387 y (ii) una segunda mutación que consiste en:

5. ADN polimerasa mu mutada según la reivindicación 4, donde la primera mutación puntual (i) en la posición 387 consiste en la sustitución del aminoácido que se encuentra dicha posición por cualquiera de los aminoácidos seleccionados del siguiente grupo: Glutamina, Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina, Metionina, Lisina, Arginina, Histidina o análogos de los mismos.

6. ADN polimerasa mu mutada según la reivindicación 5, donde la segunda mutación puntual (a) es una mutación puntual en el aminoácido que se encuentra en la la posición 275 y consiste en la sustitución del aminoácido que se encuentra en dicha posición por cualquiera de los aminoácidos seleccionados del siguiente grupo: Glutamina, Asparragina, Cisteína, Treonina, Serina, Metionina o análogos de los mismos.

7. ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la segunda mutación (b) consiste en la deleción y sustitución del loop-1 de Polμ o de un fragmento del mismo por:

8. ADN polimerasa mutada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuya secuencia es seleccionada el grupo formado por SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, fragmentos o subsecuencias de las mismas que mantengan sustancialmente su actividad transferasa terminal.

9. Polinucleótido que codifica una ADN polimerasa mu mutada, o un fragmento o subsecuencia de la misma, de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Polinucleótido según la reivindicación 9, donde su secuencia es seleccionada del grupo que comprende las secuencias SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

11. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10.

12. Célula huésped que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, o un vector según la reivindicación 11.

13. Método para la producción de una ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende: i) el cultivo de una célula huésped según la reivindicación 12 bajo condiciones que promuevan la expresión del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, y ii) el aislamiento del mutante producido.

14. Método para la elongación de un polinucleótido diana que comprende: i) poner en contacto al polinucleótido diana con la ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y nucleótidos o análogos de nucleótidos (mezcla de reacción), y ii) someter la mezcla de reacción a condiciones que favorezcan la inserción de al menos un nucleótido o un análogo del mismo en el extremo 3'OH del polinucleótido diana.

15. Método para el rellenado de huecos que comprende: i) poner en contacto a un polinucleótido diana, que comprende al menos un gap o hueco de al menos un nucleótido, con la ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y nucleótidos o análogos de nucleótidos (mezcla de reacción), y ii) someter la mezcla de reacción a condiciones que favorezcan la inserción de al menos un nucleótido o análogo de nucleótido en el extremo 3'OH de gap.

16. Método para la detección de muestras apoptóticas que comprende: i) poner en contacto una muestra, que contiene material genético de células potencialmente apoptóticas, con la ADN polimerasa mu mutada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un nucleótido o análogo de nucleótido (mezcla de reacción), ii) someter la mezcla de reacción a condiciones que favorezcan la inserción de nucleótidos o análogos de los mismos, y iii) detectar la presencia o no de inserción, donde la detección de inserción es indicativa de que la muestra es apoptótica.