MUTAGÉNESIS REVISADA PARA DESARROLLAR POLIPÉPTIDOS ALTERADOS CON PROPIEDADES POTENCIADAS.

Mutagénesis revisada para desarrollar polipéptidos alterados con propiedades potenciadas Información relacionada Todo el contenido de todas las otras patentes, solicitudes de patente y referencias citadas en la siguiente memoria descriptiva está también incorporado en el presente documento por referencia en sus totalidades. Antecedentes de la invención La mutagénesis es una herramienta potente en el estudio de estructura y función de las proteínas. Las mutaciones pueden fabricarse en la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína de interés y el gen modificado puede expresarse para producir mutantes de la proteína. Comparando las propiedades de una proteína de tipo salvaje y los mutantes generados, es a menudo posible identificar aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son esenciales para la integridad estructural y/o para la función bioquímica de la proteína, tal como su actividad de unión y/o su actividad catalítica. El número de mutantes que puede ser generarse a partir de una sola proteína, sin embargo, vuelve difícil seleccionar mutantes que sean informativos o que tengan una propiedad deseada, incluso si los mutantes seleccionados que abarcan la mutación están solamente en regiones teóricamente importantes de una proteína (por ejemplo, regiones que regiones que componen un sitio activo de una proteína). Por ejemplo, la sustitución, deleción, o la inserción de un aminoácido particular puede tener un efecto local o global en la proteína. Los procedimientos anteriores para mutagenizar los polipéptidos bien han sido demasiado restrictivos, bien demasiado inclusivos, o bien han estado limitados a desactivar la función de la proteína más que a ganar o a mejorar función. Por ejemplo, un enfoque altamente restrictivo es mutagénesis selectiva o dirigida a sitio que se usa para identificar la presencia de un sitio funcional particular o para entender las consecuencias de hacer una alteración muy específica dentro del sitio funcional. Una solicitud común de mutagénesis dirigida a sitio es el estudio de fosfoproteínas donde un residuo aminoacídico, que normalmente estaría fosforilado y permitiría al polipéptido llevar a cabo su función, se altera para confirmar el vínculo entre fosforilación y actividad funcional. Este enfoque es muy específico para el polipéptido y el residuo que se están estudiando. Por el contrario, un enfoque altamente inclusivo es la saturación o la mutagénesis al azar que se diseña para producir un gran número de mutaciones que comprenden todas las alteraciones posibles dentro de una región definida de un gen o una proteína. Esto está basado en el principio de que, generando esencialmente todas las variaciones posibles de un dominio de proteína relevante, la disposición apropiada de aminoácidos es probable que se produzca como uno de los mutantes generados al azar. Sin embargo, en la práctica, el gran número de combinaciones al azar de mutaciones generadas puede evitar la capacidad de seleccionar significativamente un candidato deseado debido a la presencia del así llamado "ruido", de muchos candidatos indeseados. Otro enfoque, referida como mutagénesis "de Guía" (véase, por ejemplo, Patentes de los EE.UU. Nºs: 5,830,650; 5,798,208) se ha usado para mutagenizar una región definida de un polipéptido sintetizando una mezcla de oligonucleótidos degenerados que, estadísticamente, contienen un grupo degradado de mutaciones. Sin embargo, debido a que se emplea síntesis de polinucleótidos degenerada, la mutagénesis de guía proporciona un número de alteraciones indeseadas además del grupo deseado de mutaciones. Por ejemplo, para introducir secuencialmente una mutación a través de una región definida de sólo cinco posiciones aminoacídicas, se debe fabricar (y rastrear) un grupo de más de 100 polinucleótidos (véase, por ejemplo, Fig. 6). De acuerdo con ello, fabricar y rastrear, por ejemplo dos o tres regiones se va haciendo crecientemente complejo, es decir, requiriendo la fabricación y el rastreo de 200 a más de 300 polinucleótidos, respectivamente, para la presencia de sólo 10 a 15 mutaciones. En aún otro enfoque lo que se ha usado para mutagenizar proteínas es mutagénesis por escaneo de alanina, donde un residuo de alanina se "escanea" a través de una parte de una proteína para identificar las posiciones donde la función de la proteína está interrumpida. Sin embargo, este enfoque sólo mira a la pérdida de función proteica por medio de sustituir un resto de alanina neutral en una posición dada, más que a la ganancia o a la mejora de función. Así, no es un enfoque útil para generar proteínas que tengan estructura y función mejoradas. De acuerdo con ello, permanece una necesidad de una forma sistemática para mutagenizar una proteína para función nueva o incrementada. La técnica anterior incluye lo siguiente: el documento W02005/003345, se refiere a un procedimiento de mutagénesis de revisión para producir una biblioteca de análogos de polipéptidos, el documento WO03/023032 se refiere a un procedimiento de evolución de péptidos y proteínas dirigida de alto rendimiento y Schultz y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 83, 6, (1986), páginas 1588-1592, se refiere a una técnica mutagénica en la que un sitio de aminoácido diana en una proteína sujeto está sustituido sistemáticamente por todos los aminoácidos. El documento WO03/089671 se refiere a un procedimiento de mutagénesis de guía de un ácido nucleico que codifica un polipéptido prototipo, el documento WO03/088911 se refiere a bibliotecas que contienen inmunoglobulinas mutadas y el documento WO01/44463 se refiere a procedimientos que usan análisis estadísticos y análisis de secuencia de 2   ADN para evaluar rápidamente la importancia funcional y estructural de cadenas laterales de proteína individual para interacciones de unión. Sumario de la invención La invención concierne a un procedimiento de mutagénesis para la generación de proteínas (o polipéptidos) novedosas o mejoradas y a bibliotecas de equivalentes de polipéptido y a los polipéptidos específicos generados por los procedimientos. El polipéptido marcado como diana para mutagénesis puede ser un polipéptido natural, sintético o manipulado, incluyendo fragmentos, análogos y formas mutantes de los mismos. En una realización, el procedimiento comprende introducir un aminoácido predeterminado en esencialmente cada posición dentro de una región definida (o en diversas regiones diferentes) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Una biblioteca de polipéptido se genera conteniendo análogos polipeptídicos que no tienen más de un aminoácido predeterminado, pero que tienen colectivamente el aminoácido predeterminado en cada posición dentro de la(s) región/regiones definida(s). Solo, este procedimiento puede ser referido como mutagénesis "de revisión" debido a que, en efecto, un aminoácido individual, predeterminado (y sólo el aminoácido predeterminado) está sustituido posición-por-posición por toda una región definida o por más regiones definidas de un polipéptido. Sin embargo, en una realización preferida, el procedimiento de LTM está mejorado usándolo para identificar aminoácidos funcionales (o así llamados "puntos calientes") de entre los aminoácidos no funcionales (o así llamados "puntos fríos") dentro de un polipéptido, o parte del mismo, para reducir adicionalmente el número de residuos a alterarse con el fin de rastrear y obtener una propiedad deseada en un polipéptido. De acuerdo con ello, el procedimiento mejorado de mutagénesis "de revisión" (LTM) (de ahora en adelante la LTM mejorada se referirá como LTM2) tiene en cuenta la identificación y construcción de un subgrupo de moléculas candidatas que representan sólo las alteraciones funcionales más relevantes en el polipéptido que después se rastrean eficientemente libres de cualquier "ruido". De forma importante, LTM2 también tiene en cuenta la construcción de una biblioteca de LTM2 que tiene ventajas superiores sobre las bibliotecas tradicionales debido a que se ha diseñado para incluir sólo alteraciones en los residuos aminoacídicos del polipéptido que es más probable que tengan un efecto sobre la función del polipéptido y por lo tanto, tras rastrear, más probables para producir una propiedad potenciada. Así, LTM2 permite a alguien "revisar" las consecuencias estructurales y funcionales de sustituir por separado un aminoácido predeterminado en cada posición aminoacídica funcional dentro de una región definida del polipéptido, segregando de este modo un producto químico de proteínas específico a la región definida sin interferencia o "ruido" algunos a partir de la generación de análogos polipeptídicos no deseados (es decir, análogos que contienen sustituciones aminoacídicas distintas de aquellas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para distinguir uno o más residuos de aminoácidos funcionales de residuos de aminoácidos no funcionales en una región definida dentro de un polipéptido que comprende, seleccionar uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un residuo de aminoácido para sustituirse por los uno o más residuos de aminoácidos seleccionados; sintetizar los polinucleótidos que codifican el polipéptido o parte del mismo comprendiendo los residuos de aminoácidos seleccionados, representando los polinucleótidos colectivamente sustituciones aminoacídicas variantes de acuerdo con los siguientes criterios: i) conteniendo cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, bien un codón requerido por la síntesis del resto de aminoácido o bien un codón para uno de los restos de aminoácido predeterminados y ii) conteniendo cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, generando por lo tanto una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos de acuerdo con (i) e (ii) expresando la biblioteca de expresión para producir análogos de polipéptidos; y rastreando los equivalentes de polipéptido para una alteración en una propiedad medible tal que se identifiquen uno o más residuo(s) de aminoácido(s) dentro del polipéptido, o de parte del mismo, según contribuyan a la propiedad medible y por lo tanto se distingan de un residuo de aminoácido no funcional, en el que el/los resto(s) de aminoácido(s) identificado(s) según contribuya(n) a una propiedad medible se determina(n) que es/son adecuado(s) para mutagénesis y el/los residuo(s) no funcional(es) se determina(n) que es/son inadecuado(s) para mutagénesis y en el que uno o más aminoácido(s) funcional(es) está(n) exclusivamente mutagenizado(s). 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mutagénesis se selecciona del grupo que consiste en mutagénesis de evaluación (LTM), mutagénesis de guía (WTM), o una combinación de las mismas. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo. 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polipéptido es un anticuerpo de cadena simple (sFVs). 5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de identificar un polinucleótido que codifica un análogo de polipéptido que tiene una alteración en una propiedad medible. 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la alteración en una propiedad medible es una propiedad potenciada tal como un antígeno de unión de alta afinidad o una función efectora mejorada. 7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el antígeno es una diana terapéutica en una enfermedad o trastorno humano. 8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rastreo comprende, poner el contacto un polipéptido con un sustrato diana, estando el polipéptido asociado con el polinucleótido que codifica el polipéptido, estando asociado el polinucleótido o polipéptido con un resto asociado, de tal forma que se detecta un polipéptido variante capaz de unir un sustrato diana y por lo tanto se identifica como codificado por el polinucleótido. 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el polinucleótido está asociado con un análogo polipeptídico usando presentación de expresión seleccionada del grupo que consiste en presentación ribosómica, presentación polisómica, presentación de fagos, presentación procariótica (de bacterias), presentación de levaduras, presentación de células eucariotas y presentación de bibliotecas dispuestas ordenadamente. 10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la(s) región/regiones definida(s) comprende(n) un dominio funcional del polipéptido seleccionado del grupo que consiste en sitio de unión a anticuerpos o parte del mismo, una región de armazón de anticuerpos, una región efectora de anticuerpos, un sitio de unión a receptor y un sitio catalítico. 11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el sitio de unión a anticuerpos o parte del mismo comprende un dominio de CDR o parte del mismo seleccionado del grupo que consiste en CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 y una combinación de las mismas, la región de armazón del anticuerpo 28   comprende un dominio seleccionado del grupo que consiste en FR1, FR2, FR3, FR4 y una combinación del mismo y la región efectora de anticuerpo comprende un dominio seleccionado del grupo constituido por un sitio de unión al complemento y una región de unión al receptor Fc. 12. Un procedimiento de generar una biblioteca de análogos polipeptídicos en los que un aminoácido predeterminado aparece en una o más posiciones aminoacídicas funcionales en una región definida del polipéptido que comprende: una o más posiciones aminoacídicas funcionales seleccionadas de acuerdo con la reivindicación 1 en una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido; determinar un residuo de aminoácidos para sustituirse en cada posición de aminoácidos funcionales dentro de la región definida; sintetizar polinucleótidos individuales que codifican la región definida, representando los polinucleótidos colectivamente polinucleótidos variantes posibles de acuerdo con los siguientes criterios: (i) contener cada polinucleótido en cada posición de codón de aminoácido funcional en la región definida, bien un codón requerido por el residuo de aminoácido del polipéptido o bien un codón para el residuo de aminoácido predeterminado y (ii) contener cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, generaro de este modo una biblioteca de polinucleótidos en la que los aminoácidos predeterminados aparecen en cada posición de aminoácidos funcionales dentro de la región definida. 13. Un procedimiento de identificar un subgrupo de análogos de polipéptidos que tienen una propiedad deseada comprendiendo: seleccionar uno o más aminoácidos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 dentro de una región definida de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, determinar un residuo de aminoácidos para sustituirse en cada posición aminoacídica en la región definida; sintetizar polinucleótidos que codifican la región definida, representar dichos polinucleótidos colectivamente polinucleótidos variantes posibles de acuerdo con los siguientes criterios: (i) contener cada polinucleótido en cada posición de codón en la región definida, bien un codón requerido por la síntesis del residuo de aminoácido del polipéptido o bien un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, y (ii) contener cada polinucleótido no más de un codón para el residuo de aminoácido predeterminado, generar por lo tanto una biblioteca de expresión que contiene los polinucleótidos; exponiendo la biblioteca de expresión a las condiciones en las que se expresa la biblioteca; rastrear la biblioteca expresada para identificar un polipéptido que tiene una propiedad deseada; comparar la propiedad del polipéptido según se compara con un criterio de control, en el que un polipéptido que corresponde o excede el criterio de control se categoriza como un elemento de respuesta y un polipéptido que falla el criterio de control se categoriza como un elemento de no respuesta; categorizar elementos de respuesta y elementos de no respuesta en una base de datos; y consultar la base de datos para determinar la secuencia de un subconjunto de polipéptidos a sintetizarse. 14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que una o más de las etapas está asistida por ordenador. 15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 en el que la propiedad está seleccionada del grupo que consiste en una especificidad de unión alterada, una velocidad de asociación (kon) alterada, una velocidad de disociación (koff) alterada y combinaciones de las mismas. 29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44