Un polipéptido aislado que comprende un extremo C que se une específicamente a PDZ deDisheveled (Dvl),

en el que dicho extremo C consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo queconsiste en: KWYGWL, KWYGWF, WKWYGWL, y WKWYGWF, y en el que el polipéptido se une a PDZ de Dvl conuna afinidad de unión de CI50 ≥ 1,5 μM o mejor, en el que CI50 es la concentración de polipéptido que bloquea el50% de la unión del dominio PDZ de Dvl a KWYGWL_COOH tal como se determinó usando el ELISA decompetición.

Moduladores de PDZ Disheveled.

SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica la prioridad de y el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/790673, presentada el 10 de abril de 2006.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y la regulación del crecimiento celular. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la ruta de señalización de wnt, y a los usos de dichos moduladores.

ANTECEDENTES

Las rutas de señalización de wnt son esenciales para el desarrollo y se han implicado en la tumorigénesis [1]. Véanse también Reya & Clevers, Nature (2005) , 434: 843-850; Logan & Nusse, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (2004) , 20: 781-810; y documento US 2004/0247593. Las proteínas Disheveled (Dvl) son proteínas estructurales que juegan un papel central en las rutas de señalización de Wnt tanto generales como no generales [2]. Véase también Wallingford & Habas, Development (2005) , 132:4421-4436. Las proteínas Dvl están compuestas por un dominio DIX con extremo N un dominio PDZ normal, y un dominio DEP con extremo C. De estos tres, el dominio PDZ juega el papel más importante en la transducción de la señal de Wnt. De los 20 ligandos naturales que se ha notificado como unidos al dominio PDZ de Dvl (a partir de ahora en la presente memoria descriptiva “DvlPDZ”

o “PDZ de Dvl”) [2-6], la mayor parte de los éstos se ha señalado como biológicamente fundamental para las rutas generales o no generales de señalización de Wnt. Se ha notificado, por ejemplo, que la unión directa de DvlPDZ a una secuencia interna en la región terminal de Frizzled juega un papel importante en la ruta de señalización de Wnt [3]. La expresión en exceso de Dvl hace de Dvl una diana farmacológica para el tratamiento del cáncer. Se han hecho esfuerzos para desarrollar antagonistas específicos de DvlPDZ basándose en el ligando peptídico derivado de Dapper y Frizzled [9]. Sin embargo, la molécula pequeña que se identificó según se ha informado se une a DvlPDZ con afinidad muy baja (Ki = 237 μM) , y no se ha resuelto completamente la eficacia in vivo. Se han descrito otros ligandos del dominio PDZ, por ejemplo, en el documento WO 2003/004604, [12] y [14]

Las importantes funciones celulares adscritas a Dvl, en particular aquellas mediadas a través de la interacción proteína-proteína entre DvlPDZ y su (s) ligando (s) , sugieren que DvlPDZ representa una significativa diana terapéutica. Sería por tanto beneficioso elucidar los aspectos mecanicistas de la interacción entre el ligando y PDZ de Dvl y proporcionar composiciones y procedimientos dirigidos a modular sus actividades funcionales asociadas. La presente invención proporciona este y otros beneficios.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Las rutas de señalización de Wnt tienen importantes papeles biológicos, y su perturbación se ha implicado en diversos cánceres. La presente invención proporciona composiciones y procedimientos de uso de estas composiciones para modular la actividad del dominio PDZ de la proteína Dvl tal como se define en las reivindicaciones. Debido a las importantes funciones asociadas con la Dvl, las composiciones y procedimientos de la invención presentan utilidades clínicas significativas. La invención está basada en parte en el extenso análisis y caracterización de las moléculas de enlace (ligandos) de PDZ de Dvl, dicho análisis da como resultado hallazgos novedosos e inesperados tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, se ha identificado una serie de ligandos peptídicos ceñidos al dominio PDZ de Dvl usando una biblioteca de péptidos con extremo C expresada en fagos. Además de los ligandos cuyo motivo de unión comprende un grupo carboxilo libre necesario, los resultados descritos en la presente memoria descriptiva demuestran que un subconjunto de ligandos de PDZ de Dvl que carecen de un extremo carboxilo libre son sorprendentemente capaces de unirse a PDZ de Dvl. Los ligandos que carecen de un extremo carboxilo libre representan un extremo N y/o secuencias internas del ligando de PDZ de Dvl que constituyen secuencias con extremo N o secuencias internas de polipéptidos. La caracterización de los ligandos dio como resultado la identificación de motivos de unión únicos que se piensa que confieren a las moléculas afinidad de unión mejorada por PDZ de Dvl. Los ligandos a modo de ejemplo que se describen en la presente memoria descriptiva son útiles para seleccionar los moduladores de la ruta de wnt mediante la modulación de la actividad del PDZ de Dvl. Además, dichos ligandos y sus derivados son por sí mismos pequeñas moléculas candidatas a fármacos para tratar las dolencias patológicas asociadas con la desregulación de las rutas de señalización de Wnt.

En un aspecto, la invención proporciona moléculas capaces de unirse específicamente a PDZ de Dvl tal como se define en las reivindicaciones. Estas moléculas son útiles en una variedad de contextos, por ejemplo, como moduladores de la interacción entre el ligando y PDZ de Dvl. Por ejemplo, la invención proporciona moléculas moduladoras que tienen características que imitan las características de los aglutinantes de alta, baja o moderada afinidad de PDZ de Dvl. En una realización, la invención proporciona un polipéptido aislado (por ejemplo, un polipéptido tal como se define a partir de ahora en la presente memoria descriptiva, que incluye específicamente moléculas peptídicas) que se une específicamente a PDZ de Dvl, en el que dicho polipéptido comprende una región con extremo C que comprende, consta, o consiste esencialmente de una secuencia con Gly en la posición -2, Trp en la posición -1, Phe o Leu en la posición 0, y un resto hidrófobo o aromático en la posición -3, en el que la numeración de los aminoácidos está basada en el resto con extremo C que está en la posición 0 tal como se define en las reivindicaciones. En una realización, la posición -6 en dicha región con extremo C es Trp.

Se describe en la presente memoria descriptiva un polipéptido aislado (por ejemplo, un polipéptido tal como se define a partir de ahora en la presente memoria descriptiva, que incluye específicamente moléculas peptídicas) que se unen específicamente a PDZ de Dvl, en el que dicho polipéptido comprende una región con extremo N o interna que comprende, consta, o consiste esencialmente de un motivo de unión que comprende Gly-Trp-[Ile o Val]-X1-X2-X3-X4 o Tyr-Gly-Trp-[Ile o Val]-X1-X2-X3-X4, en el que Gly es tanto un resto con extremo N como interno, respectivamente, y X1, X2, X3 y/o X4 son restos internos. En un ejemplo, X1-X2-X3 es G-G-G. En un ejemplo, X1-X2-X3-X4 es D-G-G-G. En un ejemplo, la Tyr está precedida en el extremo N por Asp.

Se describe también en la presente memoria descriptiva un polipéptido aislado (por ejemplo, un polipéptido tal como se define a partir de ahora en la presente memoria descriptiva, que incluye específicamente moléculas peptídicas) que se une específicamente a PDZ de Dvl, en el que dicho polipéptido comprende una región con extremo N o interna que comprende, consta, o consiste esencialmente de un motivo de unión que comprende Trp-[Ser o Thr]-Asp-[Ile o Phe o Leu]-Pro, en el que el Trp es tanto un resto con extremo N como interno, y la Pro es un resto interno. En un ejemplo, el trp está precedido en el extremo N por X1 y/o X2 (es decir, X1-X2-Trp) , en el que X1 es Leu o Val y X2 es Leu. En un ejemplo, un polipéptido aislado (por ejemplo, un polipéptido tal como se define a partir de ahora en la presente memoria descriptiva, que incluye específicamente moléculas peptídicas) se une específicamente a PDZ de Dvl, en el que dicho polipéptido comprende una región con extremo N o interna que comprende, consta, o consiste esencialmente de un motivo de unión que comprende Trp-[Ile o Val]-Asp-Gly-Pro, en el que el Trp es tanto un resto con extremo N como interno, y la Pro es un resto interno. En un ejemplo, el Trp está precedido en el extremo N por X1 y/o X2 (es decir, X1-X2-Trp) , en el que X1 es Glu y X2 es Thr, Val, Met, arg, Ile o Gln.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que se une específicamente a PDZ de Dvl con una afinidad de unión de la CI50 = 1, 5 μM o mejor. En una realización, la afinidad de unión es CI50 = 1, 2 μM o mejor. En una realización, la afinidad de unión es CI50 = 1, 0 μM o mejor. En una realización, la afinidad de unión es CI50 = 0, 8 μM o mejor. En una realización... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende un extremo C que se une específicamente a PDZ de Disheveled (Dvl) , en el que dicho extremo C consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: KWYGWL, KWYGWF, WKWYGWL, y WKWYGWF, y en el que el polipéptido se une a PDZ de Dvl con una afinidad de unión de CI50 = 1, 5 μM o mejor, en el que CI50 es la concentración de polipéptido que bloquea el 50% de la unión del dominio PDZ de Dvl a KWYGWL_COOH tal como se determinó usando el ELISA de competición.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido inhibe la señalización de Wnt mediada por Dvl endógena.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se une específicamente a PDZ de Dvl con una afinidad de unión de CI50 = 1, 0 μM o mejor.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se une específicamente a PDZ de Dvl con una afinidad de unión de CI50 = 0, 4 μM o mejor.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se une específicamente a PDZ de Dvl con una afinidad de unión de CI50 = 0, 2 μM o mejor.

6. El polipéptido aislado de la reivindicación, en el que Dvl es Dvl 1, 2 y/o 3 humanas.

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido está unido a una etiqueta de la secuencia de aminoácidos que potencia la entrada del polipéptido a la célula.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en el que la etiqueta de la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de RQIKIWFQNRRMKWKK.

9. Un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en KWYGWL, KWYGWF, WKWYGWL, WKWYGWF y RQIKIWFQNRRMKWKKKWYGWL.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Un polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar a un sujeto una cantidad eficaz de dicho polipéptido.

12. Un procedimiento para identificar un compuesto capaz de modular la interacción entre el ligando y PDZ de Dvl, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una muestra que comprende:

(i) PDZ de Dvl o uno de sus fragmentos;

(ii) uno o más de los polipéptidos de cualquiera de las reivindicaciones anteriores;

y (iii) un compuesto candidato;

y determinar la cantidad de interacción entre PDZ de Dvl y dicho polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en presencia del compuesto candidato;

por lo que un cambio en la cantidad de interacción entre PDZ de Dvl y dicho polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en presencia del compuesto candidato en comparación con la cantidad en ausencia del compuesto indica que el compuesto candidato es un compuesto capaz de modular la interacción entre el ligando y PDZ de Dvl.