MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE APOLIPOPROTEÍNA C-III.

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de apolipoproteína C- III. En particular, la presente invención se refiere a compuestos, en particular compuestos oligonucleótidos que se hibridan con moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III. Dichos compuestos se muestran en el presente documento para modular la expresión de apolipoproteína C-III. Antecedentes de la invención Las lipoproteínas son partículas globulares, similares a micelas, que constan de un núcleo no polar de acilgliceroles y ésteres de colesterilo rodeado por un recubrimiento anfífilo de proteína, fosfolípido y colesterol. Las lipoproteínas se han clasificado en cinco amplias categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan los lípidos de la dieta del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteínas de densidad intermedia (IDL); lipoproteínas de baja densidad (LDL); todas ellas transportan triacilgliceroles y colesterol del hígado a los tejidos; y lipoproteínas de alta densidad (HDL), que transportan colesterol endógeno de los tejidos al hígado. Las partículas lipoproteicas experimentan un proceso metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. Las densidades de las lipoproteínas aumentan sin disminuir el diámetro de partícula debido a que la densidad de sus recubrimientos exteriores es inferior a la del núcleo interno. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas están distribuidas en cantidades significativas entre las diversas lipoproteínas humanas. La apolipoproteína C-III es un constituyente de HDL y de lipoproteínas ricas en triglicéridos y tiene un papel en la eridemia hipertríglica, un factor de riesgo de enfermedad arterial coronaria. La apolipoproteína C-III ralentiza la eliminación de lipoproteínas ricas en triglicéridos inhibiendo la lipolisis, tanto inhibiendo la lipoproteína lipasa como interfiriendo en la unión de la lipoproteína a la matriz de glucosaminoglicano de la superficie celular (Shachter, Curr. Opin. Lipidol., 2001, 12, 297-304). El gen que codifica la apolipoproteína C-III humana (también denominada APOC3, APOC-III, APO CIII y APO C-III) fue clonado en 1984 por tres grupos de investigación (Levy-Wilson y col., DNA, 1984, 3, 359-364; Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456; Sharpe y col., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 3917-3932). La secuencia codificante está interrumpida por tres intrones (Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456). El gen de la apolipoproteína C-III humana está ubicado aproximadamente a 2,6 kb en la dirección 3 del gen de la apolipoproteína A-1 y estos dos genes se transcriben de forma convergente (Karathanasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1985, 82, 6374-6378). También se clonó una variante de la apolipoproteína C-III humana con mutación Thr74 a Ala74 a partir de un paciente con un nivel inusualmente alto de apoliproteína C-III en suero. Debido a que la Thr74 está O-glucosilada, el mutante Ala74, por lo tanto, provocó unos niveles aumentados en suero de apolipoproteína C-III que carece del resto carbohidrato (Maeda y col., J. Lipid Res., 1987, 28, 1405-1409). Se han identificado cinco polimorfismos en la región promotora del gen: C(-641) a A, G(-630) a A, T(-625) a eliminación, C(-482) a T y T(-455) a C). Todos estos polimorfismos están en desequilibrio de unión con el polimorfismo SstI en la región 3 no traducida. El sitio SstI distingue los alelos S1 y S2 y el alelo S2 se ha asociado con niveles elevados de triglicéridos en plasma (Dammerman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90, 4562-4566). El promotor de apolipoproteína C-III está regulado a la baja por la insulina y este sitio polimórfico anula la regulación de insulina. De este modo, la sobreexpresión potencial de apolipoproteína C-III resultante de la pérdida de regulación de insulina puede ser un factor que contribuya al desarrollo de hipertrigliceridemia asociada con el alelo S2 (Li y col., J. Clin. Invest., 1995, 96, 2601-2605). El polimorfismo T(-455) a C se ha asociado con un aumento del riesgo de enfermedad arterial coronaria (Olivieri y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 1450-1457). Además de la insulina, se han identificado otros reguladores de la expresión del gen de la apolipoproteína III. Un elemento de respuesta para el receptor huérfano nuclear rev-erb alfa se ha localizado en las posiciones -23/-18 en la región promotora de la apolipoproteína C-III y el rev-erb alfa disminuye la actividad del promotor de la apolipoproteína C-III (Raspe y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 2172-2179). La región promotora de la apolipoproteína C-III -86 a -74 se reconoce por dos factores nucleares CIIIb1 y CIIIB2 (Ogami y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 9640-9646). La expresión de la apolipoproteína C-III está también regulada al alza por retinoides que actúan a través del receptor X retinoide, y las alteraciones en la abundancia del receptor X de retinoides afectan a la transcripción de apolipoproteína C-III (Vu-Dac y col., J. Clin. Invest., 1998, 102, 625-632). Se ha demostrado que la proteína de especificidad 1 (Sp1) y el factor nuclear del hepatocito 4 (HNF-4) actúan de forma sinérgica para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III a través del sitio de unión HNF-4 (Kardassis y col., Biochemistry, 2002, 41, 1217-1228). El HNF-4 también actúa conjuntamente con SMAD3-SMAD4 para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III (Kardassis y col., J. Biol. Chem., 2000, 275, 41405-41414). 2 E04749914 02-12-2011   Se ha definido adicionalmente el papel de la apolipoproteína C-III en lipolisis usando ratones transgénicos e inactivados. La sobreexpresión de apolipoproteína C-III en ratones transgénicos provoca hipertrigliceridemia y una eliminación deficiente de triglicéridos VLDL (de Silva y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 2324-2335; Ito y col., Science, 1990, 249, 790-793). Los ratones inactivados con una ausencia total de la proteína apolipoproteína C-III mostraron unos niveles significativamente reducidos de colesterol y triglicéridos en plasma en comparación con ratones de tipo silvestre y estaban protegidos de hipertrigliceridemia posprandial (Maeda y col., J. Biol. chem.,1994, 269, 23610- 23616). Actualmente no existen agentes terapéuticos conocidos que afecten a la función de la apolipoproteína C-III. Se ha postulado que el efecto hipolipidémico de la clase de fármacos fibrato tiene lugar a través de un mecanismo en el que el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) media el desplazamiento de HNF-4 desde el promotor de apolipoproteína C-III, dando como resultado la supresión transcripcional de la apolipoproteína C-III (Hertz y col., J. Biol. Chem., 1995, 270, 13470-13475). Los fármacos hipolipidémicos de la clase de las estatinas también reducen los niveles de triglicéridos usando un mecanismo desconocido que da como resultado el aumento de ARNm de la lipoproteína lipasa y una disminución de los niveles en plasma de apolipoproteína C-III (Schoonjans y col., FEBS Lett., 1999, 452, 160-164). En consecuencia, existe todavía una necesidad de agentes adicionales capaces de inhibir eficazmente la función de la apolipoproteína C-III. Sumario de la invención La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido de 20 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, hibridándose específicamente dicho oligonucleótido con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibiendo la expresión de la apolipoproteína C-III, y comprendiendo dicho oligonucleótido una secuencia seleccionada de entre las SEC ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88 y tiene una secuencia que es al menos en un 90 % complementaria con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III. La presente invención también proporciona un procedimiento de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-II en células o tejidos in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de la invención de tal modo que se inhiba la expresión de apolipoproteína C-III. La presente invención también proporciona un oligonucleótido antisentido de la invención para su uso en terapia. Otros aspectos de la presente invención se establecen en las reivindicaciones. Sumario de la divulgación En el presente documento se divulgan composiciones y procedimientos para modular la expresión de apolipoproteína C-III. La tecnología antisentido surge como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y es excepcionalmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas,... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido de 20 a 30 nucleobases de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho oligonucleótido se hibrida específicamene con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III y en el que dicho oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88 y tiene una secuencia que es al menos en el 90 % complementaria a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III. 2. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleido tiene una secuencia que es al menos el 95 % complementaria a la molécula de ácido nucleido que codifica la apolipoproteína C-III. 3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleido tiene una secuencia que es al menos el 100 % complementaria a la molécula de ácido nucleido que codifica la apolipoproteína C-III. 4. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana que tiene la secuencia de la SEC ID Nº:4 o la SEC ID Nº:18. 5. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido de ADN. 6. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido de ARN. 7. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene al menos una unión entre nucleósidos, resto de azúcar o base nitrogenada modificada. 8. El nucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos un resto de azúcar 2-O-metoxietílico. 9. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos una unión entre nucleósidos de fosforotioato. 10. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos una 5-metilcitosina. 11. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido quimérico. 12. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 11, en el que dicho oligonucleótido quimérico es de 20 nucleótidos de longitud, comprendiendo diez 2-desoxinucleótidos flanqueados en cada lado por cinco 2'metoxietilnucleótidos, en el que los enlaces entre nucleósidos son fosforotioato y todos los restos de citosina son 5-metilcitosinas. 13. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 12, en el que dicho oligonucleótido quimérico consta de una secuencia seleccionada de entre las SEC ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88. 14. Un procedimiento de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III en células o tejidos in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 de tal modo que se inhiba la expresión de apolipoproteína C-III. 15. Un oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en terapia. 16. El oligonucleótiod antisentido de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una afección metabólica anormal. 17. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 15, para su uso en el tratamietno de hipertrigliceridemia, metabolismo de lípidos anormal, metabolismo de colesterol anormal, ateroesclerosis, hiperlipidemia, diabetes, obesidad, enfermedad cardiovascular o enfermedad arterial coronaria. 18. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 17, en el que dicha diabetes es diabetes de tipo 2. 132