Un método para controlar una planta modificada genéticamente, que comprende:

(a) proporcionar una planta modificada genéticamente donde las células de dicha planta modificada genéticamente contienen un ácido nucleico heterólogo y donde dicha planta modificada genéticamente es inactiva con respecto a un proceso celular de interés,

donde dicho proceso celular de interés comprende la formación de un amplicón de ARN expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo;

donde, en dicho ácido nucleico heterólogo, la secuencia que codifica el amplicón de ARN está separada de un promotor mediante un bloque de secuencia que impide una unión operativa entre el promotor y la secuencia que codifica el amplicón de ARN; estando dicho bloque de secuencia flanqueado por sitios de recombinación de forma que dicho bloque se puede cortar mediante una recombinasa que reconozca dichos sitios de recombinación; y

(b) activar dicho proceso celular de interés introduciendo directamente un polipéptido a partir de una composición sin células en células que contienen dicho ácido nucleico heterólogo; comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de translocación de membrana unida covalentemente que posibilita la introducción directa de dicho polipéptido en células que contienen dicho ácido nucleico heterólogo; y teniendo dicho polipéptido una actividad enzimática de una recombinasa específica de sitio que reconoce dichos sitios de recombinación de forma que dicho bloque se pueda cortar, estableciendo de ese modo una unión operativa para la transcripción de la secuencia que codifica el amplicón de ARN

Método para controlar procesos celulares en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para controlar un proceso celular de interés en una planta mediante una señal externa como un polipéptido aplicado externamente. El proceso de la invención permite el control selectivo de la expresión transgénica en una planta modificada genéticamente de forma transitoria o estable, por lo que un proceso celular de interés no funcional previamente en la planta se puede activar selectivamente en cualquier momento determinado.

Antecedentes de la invención

Sistemas de expresión transgénica controlables en plantas

Uno de los problemas principales en la biotecnología de plantas es la consecución de control fiable sobre la expresión transgénica. El control estricto sobre la expresión génica en plantas es esencial si un producto cadena abajo de expresión transgénica es inhibidor del cultivo o tóxico, como por ejemplo, plásticos biodegradables (Nawrath, Poirier & Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad Sci., 91, 12760-12764; John & Keller, 1996, Proc. Natl. Acad Sci., 93 12768-12773; los documentos US6103956 y US5650555) o toxinas proteicas (el documento US6140075). Las tecnologías existentes para controlar la expresión génica en plantas, habitualmente se basan en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente todos ellos sufren de una actividad basal de expresión incluso cuando no se han inducido, es decir, los mismos son "filtrantes". Los promotores específicos de tejido (documentos US05955361 y WO09828431) representan una herramienta potente pero su uso está limitado a áreas muy específicas de aplicaciones, por ejemplo, para producir plantas estériles (documento WO09839462) o expresar genes de interés en semillas (documentos WO00068388 y US05608152). Los promotores inducibles se pueden dividir en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción: aquellos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz y sustancias químicas) y aquellos que se pueden inducir mediante factores bióticos, por ejemplo, ataque por patógeno o plaga. Los ejemplos de la primera categoría son promotores inducibles por calor (documento US 05187287) e inducibles por frío (documento US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esteroides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14.247-257; documento US06063985), un sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; documento WO09321334) y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5 559-569). Uno de los últimos desarrollos en el área de sistemas químicamente inducibles para plantas es un promotor quimérico que se puede activar mediante el glucocorticoide dexametasona e inactivarse mediante tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J., 19, 87-95). Para una revisión sobre sistemas químicamente inducibles véase: Zuo & Chua, (2000, Current Opin. Biotechnol., 11. 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son los promotores que controlan la expresión de genes relacionados con patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores se pueden inducir mediante tratamiento de una planta con ácido salicílico, un componente importante de las rutas de señalización de plantas en respuesta a ataques por patógeno u otros compuestos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido isonicotínico) que son capaces de desencadenar la expresión del gen par (documento US05942662).

Existen informes de sistemas de expresión transgénica controlables que usan ARN viral/ARN polimerasa proporcionados por infección viral (por ejemplo, véanse los documentos US6093554 y US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN de planta recombinante incluye las secuencias de nucleótidos del genoma viral reconocidas por ARN viral/ARN polimerasa. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a la capacidad baja de polimerasas virales de proporcionar funciones en trans y su incapacidad de controlar procesos diferentes a la amplificación de ARN. Otra manera es desencadenar un proceso de interés en una planta transgénica usando un virus genéticamente modificado que proporcione un ácido nucleico heterólogo que codifique un interruptor para un proceso bioquímico en una planta modificada genéticamente (documento WO02068664).

Los sistemas descritos anteriormente son de interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero los mismos no permiten el control estricto sobre los patrones de expresión, ya que los agentes inductores (cobre) o sus análogos (brassinoesteroides en el caso de sistemas controlables por esteroides) pueden estar presentes en tejidos vegetales en niveles suficientes para provocar expresión residual. Adicionalmente, el uso de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable o económicamente inviable para aplicaciones a gran escala. Cuando se usan promotores de genes PR o ARN viral/ARN polimerasas como medios de control para transgenes, la necesidad de control estricto sobre la expresión transgénica tampoco se satisface, ya que la infección por patógeno casual o el estrés pueden provocar la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano están limitados a áreas muy limitadas de aplicación, ya que los mismos confinan la expresión a un órgano específico o fase del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgen se active a voluntad. Los interruptores virales recombinantes como se han descrito en el documento WO02/068664 se dirigen a todos estos problemas, pero no garantizan los requerimientos de seguridad ambiental estrictos, ya que el ácido nucleico heterólogo en el vector viral se puede recombinar.

Existe bibliografía abundante que incluye solicitudes de patentes que describen el diseño de plantas resistentes a virus mediante la expresión de genes virales o formas mutadas de ARN viral (por ejemplo, los documentos US5792926 y US6040496). Sin embargo, existe un riesgo ambiental asociado con el uso de tales plantas debido a la posibilidad de formar virus novedosos mediante recombinación entre el virus de estimulación y el ARN o ADN viral transgénico (Adair & Kearney, 2000, Arch. Virol, 145. 1867-1883).

Hooykaas y sus colegas (2000, Science, 290, 979-982; documento WO01/89283), han descrito el uso de una fusión traduccional de recombinasa Cre con fragmentos de gen vir para translocación de recombinasa mediada por Agrobacterium en células vegetales. Los acontecimientos de recombinación in planta mediada por Cre dio como resultado un fenotipo seleccionable. La translocación de recombinasa Cre es el primer uso de una proteína translocada como un interruptor para desencadenar un proceso de interés en células vegetales. Sin embargo, a pesar de que la translocación no está acompañada necesariamente por transferencia de ADN, este enfoque no garantiza un nivel de seguridad elevado, ya que el microorganismo fitopatógeno genéticamente modificado (Agrobacterium) posee una secuencia codificante completa de la proteína interruptora de recombinasa Cre. Además, el proceso de interés sólo se puede desencadenar en células que reciben la proteína interruptora. Si se tienen que tratar grandes conjuntos celulares, la proporción de células que recibe la proteína interruptora al número total de células se vuelve muy pequeña. Por lo tanto, el método de Hooykaas no se puede aplicar a plantas enteras. En lugar de ello, su utilidad está limitada a células en cultivo de tejido o cultivo celular.

Por lo tanto, es un objeto proporcionar un método para activar un proceso celular de interés en plantas enteras. Es otro objeto de la invención proporcionar un método seguro para el entorno para activar un proceso celular de interés en plantas, mediante el cual el proceso celular se puede activar selectivamente en cualquier momento predeterminado. Es otro objeto proporcionar un método para producir un producto en una planta transgénica, en el que la producción del producto se puede activar selectivamente después de que la planta ha crecido hasta una fase deseada, por lo que el proceso es seguro con respecto al entorno en el sentido de que el material genético necesario para dicho proceso celular y el material genético que codifica la función de control no se propagan en el entorno juntos.

Descripción general de la invención

Los objetos anteriores se consiguen mediante un método para controlar una planta modificada genéticamente, como se ha definido en la reivindicación 1 y 2.

También...

1. Un método para controlar una planta modificada genéticamente, que comprende:

2. Un método para controlar una planta modificada genéticamente que comprende:

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha activación de dicho proceso celular de interés comprende la formación de una proteína a partir de dicho ácido nucleico heterólogo.

4. El método de la reivindicación 3, donde dicha proteína es capaz de propagarse a otras células de dicha planta, comprendiendo dicha proteína una porción de proteína que dota a dicha proteína con la capacidad de dejar una célula y entrar en otras células de dicha planta, en el que dicha porción de proteína se selecciona entre el siguiente grupo: una proteína de movimiento viral, proteína de cubierta viral, factor de transcripción vegetal o animal y mensajero intercelular peptídico vegetal o animal.

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho amplicón expresable tiene capacidad de movimiento de célula a célula o sistémico en dicha planta.

6. El método de una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha planta es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de forma estable en el genoma nuclear.

7. El método de una de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicha planta es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de forma estable en el genoma del plástido.