Microesferas con propiedades fluorescentes y magnéticas.

Una microesfera (10) que comprende:

- una microesfera central (46),

- un material magnético (44) acoplado a una superficie de la microesfera central (46), y

- una capa (48) de polímero que rodea el material magnético (44) y la microesfera central (46).caracterizada porque

un 50% o menos de la superficie de la microesfera central (46) está cubierto por el material magnético (44) y porqueel material magnético comprende partículas o agregados de partículas que tienen un tamaño de 10 nm a 1000 nm.

Microesferas con propiedades fluorescentes y magnéticas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de las microesferas para su uso en aplicaciones basadas en la fluorescencia. Determinadas formas de realización se refieren a una microesfera que incluye un material magnético acoplado a una superficie de una microesfera central y a una capa de polímero que rodea el material magnético y la microesfera central. En particular, la invención se refiere a una microesfera de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1, al uso de dicha microesfera y a un procedimiento para formar dichas microesferas.

2. Descripción de la técnica relacionada

La descripción y los ejemplos que siguen no se consideran como técnica anterior en virtud de su inclusión en la presente sección.

Las microesferas magnéticas son utilizadas en la actualidad en una amplia variedad de aplicaciones entre las que se incluyen: el tratamiento hipertérmico de tumores; la administración dirigida de sustancias terapéuticas sobre zonas seleccionadas en sistemas de seres vivos; el aislamiento de células, polinucleótidos y de proteínas; el análisis químico de biomoléculas. Las microesferas indicadas para dichos fines se encuentran disponibles en diversas fuentes comerciales en una pluralidad de configuraciones diferentes. Estas microesferas a menudo incluyen una sustancia magnéticamente susceptible y un material matricial esférico, como por ejemplo un polímero orgánico o sílice. Las microesferas pueden presentar diversas configuraciones, como por ejemplo un núcleo magnético rodeado por una matriz; pequeñas partículas magnéticas dispersas por toda la matriz; y un revestimiento magnético dispuesto sobre el exterior de una matriz esférica. Cada una de estas configuraciones microesféricas presenta ventajas e inconvenientes, y la selección de la configuración apropiada depende del uso final de las microesferas.

En muchas aplicaciones, las microesferas de referencia muestran paramagnetismo o superparamagnetismo, más que ferromagentismo. Dichas microesferas presentan un magnetismo desdeñable en ausencia de un campo magnético, pero la aplicación de un campo magnético induce a la alineación de los dominios magnéticos dentro de las microesferas, lo que se traduce en la atracción de las microesferas hacia la fuente del campo. Cuando el campo es suprimido, los dominios magnéticos vuelven a una orientación aleatoria de forma que no hay atracción o repulsión magnética interparticular. En el caso del superparamagnetismo, este retorno a la orientación aleatoria de los dominios es casi instantánea, mientras que los materiales paramagnéticos retendrán la alineación de los dominios durante algún tiempo después de la supresión del campo magnético. Esta retención de la alineación de los dominios puede conducir a una agregación de las microesferas en ausencia de un campo magnético externo, lo cual a menudo no es deseable. Los materiales ferromagnéticos presentan unos dominios permanentemente alineados, de manera que las microesferas que incluyen dichos materiales magnéticos fácilmente se agregarán.

El material matricial asociado con el material magnético varía también dependiendo del destino final de las microesferas, siendo el sílice y el látex de polímero los materiales matriciales más habitualmente utilizados. Ambos materiales pueden ser utilizados para crear microesferas magnéticas sustancialmente uniformes en una amplia gama de diámetros. Las microesferas magnéticas de sílice son a menudo más rentables en una gama más amplia de temperaturas que las microesferas hechas de polímeros orgánicos como por ejemplo polistireno, y ambos materiales se pueden descomponer en determinados entornos, como por ejemplo disolventes ácidos o aromáticos. Así mismo, las microesferas de sílice son a menudo más densas que las microesferas de látex, lo cual puede constituir un factor importante en la elección de las matrices de las microesferas magnéticas.

Un uso considerable y en aumento de las microesferas magnéticas es el desarrollado en el campo de los ensayos biológicos. Los ensayos de proteínas y de oligonucleótidos pueden llevarse a cabo sobre la superficie de las microesferas, las cuales pueden, a continuación, ser separadas magnéticamente de la mezcla de reacción antes de que se midan las características de las microesferas. El aislamiento de las microesferas de ensayos antes de la medición reduce la interferencia de las moléculas no seleccionadas como objetivo produciendo de esta manera unas mediciones con unos resultados más precisos.

Paralelamente con el interés en auge en las microesferas magnéticas para ensayos biológicos, encontramos el desarrollo de ensayos llevados a cabo en microesferas fluorescentes. El uso de marcas fluorescentes o de material fluorescente acoplado a una superficie de las microesferas o incorporado dentro de las microesferas hace posible la preparación de numerosos conjuntos de microesferas que pueden ser distinguidos en base a los diferentes espectros de la emisión de los tintes y / o a la intensidad de las señales. En un ensayo biológico, la fluorescencia y la difusión de la luz de estas microesferas pueden ser medidas por un citómetro de flujo o por un sistema de formación de imágenes, y los resultados de la medición pueden ser utilizados para determinar el tamaño y la fluorescencia de las microesferas así como la fluorescencia asociada con el sistema del ensayo que está siendo estudiado (por ejemplo, un anticuerpo marcado de modo fluorescente dentro de un ensayo de “sándwich de captura”) , tal y como se describe en la Patente estadounidense No. 5, 948, 627 de Lee et al.

Mediante la modificación de las concentraciones de los múltiples tintes incorporados en las microesferas, cientos, o incluso miles de conjuntos de microesferas distinguibles pueden ser obtenidos en un ensayo, pudiendo cada conjunto de microesferas ser asociado con un objetivo diferente, haciendo posible con ello se lleven a cabo numerosas pruebas respecto de una sola muestra dentro de un único recipiente, tal y como se describe en la Patente estadounidense No. 5, 981, 180 de Chandler et al.

Las microesferas distinguibles por su fluorescencia pueden ser mejoradas haciendo que estas microesferas sean magnéticamente sensibles.

Ejemplos de procedimientos para la formación de microesferas magnéticas fluorescentes se describen en la Patente estadounidense No. 6, 283, 079 de Wang et al. Los procedimientos descrittos por Wang et al. incluyen el revestimiento de una microesfera central fluorescente con magnetita y un polímero general o la mezcla de una microesfera central con magnetita, con monómeros polimerizables y el inicio de una polimerización para obtener una microesfera revestida. Estos procedimientos constituyen unos sistemas relativamente sencillos relacionados con la síntesis de microesferas magnéticas fluorescentes, pero no son adecuados para la creación de grandes números de microesferas teñidas con precisión utilizadas en análisis en múltiplex como los descritos en la Patente estadounidense No. 5, 981, 180 de Chandler et al.

Esta limitación de los procedimientos de Wang et al. es debida al hecho de que la mayoría de las moléculas de tinción fluorescentes son extremadamente sensibles al ataque por parte de especies radicales generadas durante las polimerizaciones de iniciación por radicales. Si estos radicales desactivan incluso un número relativamente pequeño de moléculas de tinción no pueden conseguirse cantidades precisas de tinte dentro de las microesferas. Así mismo, si los procedimientos de Wang et al. son utilizados para sintetizar microesferas magnéticas no fluorescentes, y la tinción de las microesferas se intenta utilizando el procedimiento de hinchado en un disolvente descrito en la patente estadounidense No. 6, 514, 295 de Chandler et al., se liberará de las microesferas una cantidad relativamente considerable del material magnético durante la tinción, dado que el material magnético no queda típicamente ligado con las microesferas. En particular, el atrapamiento físico del material magnético de las microesferas resultará alterado por el proceso de hinchado, y el material magnético será liberado dentro de la solución.

Las microesferas magnéticas fluorescentes, se describen, así mismo, en la Patente estadounidense No. 6, 268, 222 de Chandler et al.. En este procedimiento, unas nanoesferas están acopladas a una microesfera... [Seguir leyendo]

1. Una microesfera (10) que comprende:

- una microesfera central (46) ,

- un material magnético (44) acoplado a una superficie de la microesfera central (46) , y

- una capa (48) de polímero que rodea el material magnético (44) y la microesfera central (46) .

caracterizada porque

un 50% o menos de la superficie de la microesfera central (46) está cubierto por el material magnético (44) y porque el material magnético comprende partículas o agregados de partículas que tienen un tamaño de 10 nm a 1000 nm.

2. La microesfera (10) de la reivindicación 1,

caracterizada porque

la microesfera central (46) comprende uno o más grupos funcionales acoplados a la superficie de la microesfera central (46) .

3. La microesfera (10) de la reivindicación 1,

caracterizada porque

comprende así mismo un material magnético adicional acoplado a una superficie exterior de la capa de polímero y una capa adicional (52) de polímero que rodea el material magnético adicional.

4. Una población de microesferas que comprende dos o más subconjuntos de microesferas configurados para manifestar diferentes propiedades magnéticas,

caracterizada porque

las microesferas individuales de los dos o más subconjuntos comprenden una cualquiera de las microesferas (10) de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El uso de las microesferas individuales de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende así mismo uno o más fluorocromos dentro de dos o más subconjuntos para un procedimiento de análisis de un ensayo, comprendiendo el procedimiento:

el suministro de una muestra para la medición que comprende una población de microesferas con los dos o más subconjuntos de microesferas dentro de una cámara de visualización de un sistema para llevar a cabo las mediciones,

donde los dos o más subconjuntos están configurados para manifestar propiedades fluorescentes distintas, propiedades magnéticas distintas, o propiedades fluorescentes y magnéticas distintas;

- la iluminación de dos o más subconjuntos de microesferas dentro de la cámara de visualización;

- la detección de la flluorescencia emitida por las microesferas (10) por parte de unos sistemas de detección (28, 30, 32) y / o la detección de la luz difundida por las microesferas (10) por parte de un sistema de detección (26) ;

- la determinación de una identidad de las microesferas en base a las señales de salida que responden a la fluorescencia emitida por las microesferas (10) , y

- la determinación de una reacción que está teniendo o ha tenido lugar sobre la superficie de las microesferas en base a las mediciones de la fluorescencia de las microesferas.

6. El uso de la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de depósito del ensayo dentro de la cámara del sistema de medición de ensayos comprende el depósito del ensayo dentro de una cubeta de un citómetro de flujo.

7. El uso de la reivindicación 5,

caracterizado porque

la etapa de iluminación de los dos o más subconjuntos de microesferas dentro de la cámara de visualización comprende la iluminación de los dos o más subconjuntos de microesferas (10) con múltiples fuentes (14) de luz.

8. El uso de la reivindicación 5,

caracterizado porque

comprende así mismo la detección de la luz difundida por las microesferas (10) y la determinación de un diámetro o tamaño de las microesferas (10) .

9. El uso de la reivindicación 5,

caracterizado porque

comprende así mismo la detección de la luz difundida por las microesferas (10) y la identificación de más de una microesfera (10) que estén pegadas entre sí o que pasen por una zona de iluminación aproximadamente al mismo tiempo.

10. El uso de la reivindicación 5,

caracterizado porque

la etapa de depósito del ensayo dentro de la cámara del sistema de medición de ensayos comprende el depósito del ensayo dentro de una cámara de visualización dentro de un sistema de formación de imágenes estático.

11. Un procedimiento para la formación de microesferas que manifiesta propiedades magnéticas, que comprende:

- la combinación de microesferas centrales (46) con un material magnético (44) , de tal manera que el material magnético (44) se acopla a una superficie de las microesferas centrales (46) para formar unas microesferas centrales magnetizadas (46) ; y

- la combinación de las microesferas centrales magnetizadas (46) con uno o más materiales polimerizables, de tal manera que los uno o más materiales polimerizables forman una capa (48) de polímero que rodea las microesferas centrales magnetizadas (46) formando de esta manera las microesferas (10) que manifiestan propiedades magnéticas,

caracterizado porque un 50% o menos de la superficie de las microesferas centrales (46) está cubierto por el material magnético (44) que comprende partículas o agregados de partículas que tienen un tamaño de 10 nm a 1000 nm y porque comprende así mismo la separación de las partículas magnéticas por tamaños en un primer grupo y en un segundo grupo, en el que una porción sustancial de las partículas magnéticas del primer grupo tiene un tamaño de 10 nm o mayor, en el que una porción sustancial de las partículas magnéticas del segundo grupo tiene un tamaño de 10 nm o menor, y en el que el material magnético (44) combinado con las microesferas centrales (46) comprende el primer grupo de partículas magnéticas.

12. El procedimiento de la reivindicación 11,

caracterizado porque

comprende así mismo la combinación de las microesferas formadas (10) con un material magnético adicional (44) , de tal manera que el material magnético adicional (44) se acopla con una superficie exterior de la capa (48) de polímero y forma una capa adicional (52) de polímero que rodea el material magnético adicional.

13. El procedimiento de la reivindicación 11,

caracterizado porque

comprende así mismo el hinchado de las microesferas formadas (10) dentro de un disolvente que contiene fluorocromo, de tal manera que el fluorocromo migra hacia el interior de las microesferas formadas (10) y la modificación de una o más propiedades del disolvente que contiene fluorocromo de tal manera que las microesferas formadas (10) se contraen atrapando de esta forma el fluorocromo dentro de las microesferas formadas (10) .

14. El procedimiento de la reivindicación 11,

caracterizado porque

comprende así mismo la incorporación de uno o más fluorocromos dentro de las microesferas centrales (46) antes de la combinación de las microesferas centrales (46) con el material magnético (44) .

15. El procedimiento de la reivindicación 11,

caracterizado porque

comprende así mismo el acoplamiento de uno o más grupos funcionales con una superficie exterior de la capa (48) de polímero.

16. El procedimiento de la reivindicación 11,

caracterizado porque

la capa de polímero se forma en ausencia de agentes tensoactivos y estabilizadores.