La invención se relaciona con métodos para la identificación de compuestos capaces de alterar el desarrollo embrionario,

es decir, compuestos con actividad embriotóxica o teratogénica. En concreto, la invención se basa en la capacidad de dichos compuestos de alterar la actividad NTE en células madre, de forma que es posible el uso de dichas células para detectar compuestos químicos con capacidad teratogénica o de alteración de la reproducción. Las alteraciones pueden ser a nivel de expresión génica o proteica, o a nivel enzimático. La invención se relaciona también con células madre modificadas en que expresan un gen reportero bajo el control del promotor del gen NTE así como a los usos de dichas células para la identificación de compuestos con actividad embriotóxica.

Métodos y composiciones para la identificación de compuestos embriotóxicos.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con el campo de la toxicología y, más concretamente, con el desarrollo de métodos para la determinación de la embriotoxicidad de un compuesto basados en la identificación de un gen cuya expresión se ve alterada en presencia de un compuesto embriotóxico.

Antecedentes de la invención

Una de las principales causas del descarte de compuestos terapéuticos candidatos es su toxicidad reproductiva o embriotoxicidad. Sustancias con actividad mutagénica, embriotóxica o teratogénica pueden ejercer un efecto citotóxico directamente y/o provocar alteraciones del desarrollo embrionario como resultado de mutaciones en el DNA. Además, los defectos de desarrollo pueden ser generados por la interferencia de las sustancias mutágenas o embriotóxicas en los procesos de regulación de la proliferación y diferenciación como consecuencia de alteraciones en el nivel de expresión de genes y proteínas.

La mayoría de los conocimientos actuales sobre la toxicidad de productos químicos proviene de datos obtenidos mediante ensayos con animales. Aunque los estudios en modelos animales son útiles para determinar posibles efectos en la reproducción de los fármacos y productos químicos, los resultados de los estudios en animales no garantizan que estos agentes tengan los mismos efectos reproductivos en seres humanos, probablemente debido al menos en parte a la diferencia en la composición genética de los animales y los seres humanos.

Hasta la fecha, todos los compuestos que llegan a fase clínica deben ser analizados en modelos animales para evaluar los posibles efectos de dichos compuestos en la reproducción. Estas pruebas in vivo requiere mucho tiempo, son caros, y tienen que llevarse a cabo en un elevado número de animales de laboratorio. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos alternativos para probar la toxicidad potencial en la reproducción de las sustancias químicas que no requieran el uso de animales. Asimismo, existe una presión creciente en muchos países por reducir en la mayor medida posible el uso de animales de laboratorio.

En las últimas dos décadas, se han establecido sistemas de cultivos celulares como modelos de selección celular en toxicología. Sin embargo, en muchos casos, estos modelos in vitro usando cultivos primarios o líneas celulares establecidas no representaban las propiedades funcionales de las células somáticas especializadas puesto que el cultivo in vitro resulta a menudo en una pérdida de la capacidad de proliferación, de la viabilidad y de las propiedades específicas del tejido durante el cultivo a largo plazo.

También se han desarrollado métodos in vitro para determinar toxicidad y teratogenicidad de compuestos mediante el uso de embriones de mamíferos y de órganos de embriones. Estos procedimientos tienen la gran desventaja de que requieren el uso de un gran número de mamíferos vivos, en especial ratas y ratones. El uso de estos sistemas para la evaluación de embriotoxicidad es raro, porque el valor predictivo de la utilización de estos sistemas es de aproximadamente 70%. Además, estos estudios son lentos, laboriosos, costosos, requieren un alto nivel de habilidad técnica, y requieren su aprobación previa por distintos instituciones en cada país.

Recientemente se han desarrollado métodos para la detección de la embriotoxicidad de un compuesto basados en células pluripotentes derivadas de blastocistos. Este tipo de métodos monitoriza el efecto del compuesto ensayado en el proceso de diferenciación celular y, en concreto, en el cambio en el contenido de proteínas (Hulme et al., 1990, supra), en el tamaño de la colonia (Newall y Beedles 1994, 1996, supra), en actividad enzimática (Laschinski, et al., 1991, supra, Newall y Beedles, 1994, 1996, supra, Spielmann, et al., 1997, supra), y en la expresión de receptores de superficie (Hooghe y Ooms, Toxicol. In Vitro 9:349-354, 1995).

El ensayo con células madre embrionarias ("EST") (Spielmann, H., et al., 1997, In Vitro. Toxicol. 10, 119-127) es actualmente el ensayo más prometedor para predecir el potencial embriotóxico de compuestos. El método EST utiliza dos líneas celulares establecidas, los fibroblastos de ratón 3T3 como modelo de línea celular adulta, y las células madre embrionarias de ratón D3 y se basa en determinar la concentración de compuesto capaz de inducir un descenso del 50% en la viabilidad de ambas líneas celulares tras exposición crónica durante 10 días. Además, también se determina la concentración del compuesto capaz de inhibir en un 50% de diferenciación espontánea de las células D3 a cardiomiocitos. Utilizando estos tres parámetros se aplica una función estadística capaz de discriminar entre 3 diferentes niveles de embriotoxicidad: no embriotoxicidad, embriotoxicidad débil o embriotoxicidad fuerte (Spielmann et al., 1997).

El método EST ha pasado ya los correspondientes estudios de prevalidación (Scholz et al., 1999) y validación (Spielmann et al., 2006), mostrando una capacidad de predicción de embriotóxicos fuertes del 100% y del 70% para embriotóxicos débiles o no embriotóxicos. Estos estudios han llevado al ECVAM a considerar que el método necesita mejoras antes de ser usado incorporado a la legislación con finalidades reguladoras.

La principal limitación del método EST radica en el protocolo de cuantificación del grado de diferenciación de la célula tratada a cardiomiocitos. Este protocolo se basa en la determinación mediante microscopía óptica de si el cuerpo embrionario generado tras 10 días de exposición es o no contráctil, de modo que a cada cuerpo embrionario se clasifica en diferenciado o no diferenciado como un todo, sin tener en cuenta que la diferenciación del cuerpo embrionario puede ser parcial y no total, y que entre los distintos cuerpos embrionarios podría haber diferencias en el área con capacidad de contracción. Además de lo anterior, una fuente de variabilidad adicional en la determinación de la diferenciación es que ésta se establece por simple observación microscópica del cuerpo embrionario, por lo que la destreza y criterio del operador también pasa a ser un factor determinante.

Diversos estudios han propuesto mejoras al método EST. Así por ejemplo, se ha propuesto el uso de combinaciones de datos in vitro y estudios farmacocinéticos (Verwei et al., 2006), la optimización de los protocolos de cultivo de las células D3 (De Smedt et al., 2008); el uso de sistemas automatizados de análisis de imagen (Paparella et al., 2002; Peters et al., 2008); la cuantificación de la diferenciación mediante la expresión de los genes de actina y cadena pesada de miosina (Seiler et al., 2004); o la cuantificación de la diferenciación inducida a células endoteliales mediante genes marcadores específicos de dicho linaje (Festag et al., 2007a).

El documento WO97/01644 describe un método para la identificación de compuestos con actividad teratogénica basado en la capacidad de dichos compuestos de interferir en la expresión de genes que se encuentran bajo control de un promotor asociado a la diferenciación celular en células madre embrionarias de rata o ratón en las que se ha inducido un proceso de diferenciación.

WO97/13877 describe un método para evaluar la toxicidad de un compuesto en un organismo mediante la determinación de un perfil de expresión genética de una serie de tejidos seleccionados.

WO0034525 describe un método para la identificación de la embriotoxicidad de compuestos químicos mediante la determinación del perfil de expresión génica en un cuerpo embrionario.

No obstante, a pesar de los avances en el desarrollo de métodos in vitro para determinar la embriotoxicidad de productos químicos, todavía hay una necesidad de desarrollar métodos de ensayo que superen los inconvenientes de los métodos conocidos en el estado de la técnica.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar la embriotoxicidad de un compuesto que comprende

1. Un método para determinar la embriotoxicidad de un compuesto que comprende

en donde una alteración en los niveles de expresión de dicha secuencia codificante con respecto a los niveles observados en ausencia de dicho compuesto es indicativo de que el compuesto es embriotóxico.

2. Un método según la reivindicación 1 en donde la alteración en los niveles de expresión de dicha secuencia codificante es una disminución con respecto a los niveles observados en ausencia de dicho compuesto.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2 en donde la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria.

4. Un método según la reivindicación 3 en donde la célula madre embrionaria se encuentra formando parte de un cuerpo embrionario.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la célula madre pluripotente es de ratón o de origen humano.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la determinación de los niveles de expresión de la secuencia codificante se lleva a cabo mediante la determinación de un parámetro seleccionado del grupo consistente en

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la secuencia codificante codifica NTE.

8. Un método según la reivindicación 7 en donde los niveles de expresión de la secuencia codificante se determinan mediante la determinación de un parámetro seleccionado del grupo consistente en los niveles del ARNm que codifica NTE y la actividad enzimática de la proteína NTE.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la secuencia codificante es un gen reportero.

10. Una célula que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de interés en donde dicho polinucleótido se encuentra bajo el control del promotor del gen NTE, en donde dicho polinucleótido de interés no comprende una secuencia que codifica NTE.

11. Una célula según la reivindicación 10 en donde dicha célula es una célula madre pluripotente.

12. Una célula según la reivindicación 11 en donde dicha célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria.

13. Una célula según la reivindicación 12 en donde dicha célula madre embrionaria es de ratón o de origen humano.

14. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en donde dicho polinucleótido que codifica una proteína de interés es un gen reportero.

15. Uso de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 para la determinación de la embriotoxicidad de un compuesto.