Métodos, reactivos y kits para el ensayo de luciferasa.

Método de detección de la actividad de luciferasa en una muestra que comprende luciferasa utilizandocoelenterazina o un análogo de la misma como sustrato,

que comprende:

a) iniciar la producción de luminiscencia catalizada por luciferasa mediante el contacto de dicha muestracon un reactivo de detección de luciferasa para producir una mezcla de reacción, comprendiendo dichoreactivo coelenterazina y, como mínimo, una fuente de yoduro en una cantidad suficiente para generaryoduro de 0,02 a 100 mM,

b) incubar dicha mezcla de reacción bajo condiciones adecuadas para producir luminiscencia, y

c) medir la luminiscencia producida.

Métodos, reactivos y kits para el ensayo de luciferasa

La presente invención se refiere a métodos, reactivos y kits para detectar la actividad de enzimas utilizando bioluminiscencia. En particular, se refiere a un nuevo sistema de ensayo de luciferasa con una luminiscencia de base reducida para permitir un incremento de la sensibilidad de la detección.

Las luciferasas son enzimas utilizadas habitualmente como informadoras cuando se analizan sucesos moleculares en las células. Cuando se utilizan como informadoras, la cantidad de luciferasa en una célula puede ser indicativa de un suceso celular o afección particular. Por lo tanto, se han desarrollado muchos ensayos para medir la cantidad de luciferasa contenida en muestras biológicas. Estos ensayos implican habitualmente la evaluación de la cantidad de luciferasa presente en la muestra mediante la medición de la cantidad de actividad enzimática de luciferasa, y la actividad enzimática de luciferasa se refleja por la destrucción de sustrato enzimático de luciferasa o la creación de un producto de reacción correspondiente. Las luciferasas pueden reaccionar con un sustrato adecuado para producir luz como uno de los productos de reacción. La cantidad de luz de esta reacción luminiscente se puede medir y utilizar para determinar la presencia o la cantidad de luciferasa en una muestra.

Las luciferasas que utilizan coelenterazina como sustrato para producir luminiscencia incluyen Renilla, Gaussia, Metridia y Obelia. Estas luciferasas catalizan la oxidación de coelenterazina para producir coelenteramida, CO2 y luz. Esta reacción se muestra a continuación:

Es conocido que la coelenterazina se puede oxidar y producir luz en ausencia de luciferasa. La luminiscencia producida de este modo se denomina autoluminiscencia. Esta autoluminiscencia crea una señal de base y, de este modo, reduce la sensibilidad de los ensayos de detección de la luciferasa. En particular, la autoluminiscencia de la coelenterazina reduce la capacidad de detectar pequeñas cantidades de luciferasa, tales como cuando la señal de autoluminiscencia es de magnitud similar a la señal luminiscente generada por la luciferasa.

La autoluminiscencia de la coelenterazina no deseada se puede incrementar mediante ciertos componentes de ensayo, que incluyen componentes de la muestra a analizar y componentes de ensayo deseados, tales como detergentes y proteínas. Por ejemplo, los detergentes no iónicos se utilizan a menudo como agentes de lisis celular para solubilizar la luciferasa y hacer que el sustrato sea accesible, mientras que las proteínas están habitualmente presentes en muestras a analizar (por ejemplo, células, medios de cultivo celular complementados con suero) . De este modo, bajo muchas condiciones de ensayo deseables, la autoluminiscencia de la coelenterazina puede reducir la sensibilidad de los ensayos de luciferasa.

Por lo tanto, la presente invención se dirige a reducir dicha autoluminiscencia de coelenterazina no deseada, incrementando de este modo la sensibilidad del ensayo de detección de la luciferasa y permitiendo la detección de cantidades inferiores de luciferasa. Tal como se describe en el presente documento, se han identificado las condiciones para reducir la autoluminiscencia de la coelenterazina y análogos de la misma. De manera específica, se ha observado que la adición de yoduro a una mezcla de reacción de luciferasa puede reducir de manera significativa la autoluminiscencia de la coelenterazina.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método de detección de la actividad de la luciferasa en una muestra que comprende luciferasa utilizando coelenterazina o un análogo de la misma como sustrato, que comprende: (a) iniciar la producción de luminiscencia catalizada por luciferasa mediante el contacto de dicha muestra con un reactivo de detección de luciferasa para producir una mezcla de reacción, comprendiendo dicho reactivo coelenterazina y, como mínimo, una fuente de yoduro en una cantidad suficiente para generar de 0, 02 a 100 mM de yoduro, (b) incubar dicha mezcla de reacción bajo condiciones adecuadas para producir luminiscencia y (c) medir la luminiscencia producida.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “fuente de yoduro” se refiere a cualquier compuesto capaz de proporcionar iones yoduro en una solución acuosa. Un ion yoduro es un átomo de yodo con una carga –1. De este modo, los compuestos con yodo en estado de oxidación formal –1 se denominan yoduros. Entre éstos se incluyen compuestos iónicos, tales como sales de yoduro. En vista de la compatibilidad requerida con las condiciones de ensayo, naturalmente es preferente la utilización de una fuente de yoduro que sea soluble bajo condiciones acuosas. La mayoría de los yoduros iónicos son solubles, con la excepción del yoduro de plata amarillo y el yoduro de plomo amarillo. Una prueba química para un compuesto de yoduro es acidificar el compuesto acuoso mediante la adición de algunas gotas de ácido, para eliminar cualquier ion carbonato presente, a continuación la adición de nitrato de plomo, produciendo un precipitado amarillo brillante de yoduro de plomo. La fuente particular de yoduro será a elección del usuario y se puede seleccionar en base a factores, tales como la solubilidad, la toxicidad y la disponibilidad de sales de yoduro. Entre las fuentes de yoduro de ejemplo se incluyen sales de yoduro, tales como NaI, KI, LiI, NH4I y similares, y en cualquier combinación entre sí. También para utilizar en la realización de la presente invención están los compuestos de yoduro que se disocian en cierto grado para producir yoduro libre en solución.

Tal como se ejemplifica en los siguientes ejemplos, la autoluminiscencia de la coelenterazina y sus análogos se reduce de manera significativa cuando una mezcla de reacción de luciferasa que comprende coelenterazina también comprende, como mínimo, una fuente de yoduro. Se observó que la capacidad del yoduro para reducir la autoluminiscencia de la coelenterazina y sus análogos era independiente del tipo de luciferasa analizado, de manera que este efecto se observó cuando se analizaron luciferasas Renilla y Gaussia. Además, el yoduro era eficaz para reducir la autoluminiscencia de nueve análogos diferentes de coelenterazina (ejemplo 6) . Por lo tanto, en una realización, la coelenterazina utilizada, según la presente invención, se selecciona del grupo que comprende coelenterazina nativa y análogos de coelenterazina, tales como coelenterazina cp, coelenterazina f, coelenterazina fcp, coelenterazina h, coelenterazina hcp, coelenterazina i, coelenterazina ip y coelenterazina n. La coelenterazina o análogos de la misma se pueden utilizar en una concentración utilizada normalmente. En una realización, la coelenterazina o un análogo de la misma está presente en la mezcla de reacción en una concentración de 2-5 !M, preferentemente en presencia de un agente quelante metálico, por ejemplo, una solución tampón de EDTA 1-10 mM que tiene un pH entre 7, 2-8, 0. Las mezclas de reacción de luciferasa que comprenden una fuente de yoduro son conocidas en la técnica. El documento WO96/4098 se refiere a agentes desactivadores y ensayos para la luminiscencia mediada por enzima. Da a conocer un método para reducir la “comunicación entrecuzada refractiva” (“refractive cross talk") entre pocillos de muestras diferentes utilizando un reactivo desactivador que se añade a la mezcla de reacción después del inicio y la detección de la producción de luminiscencia catalizada por luciferasa. De este modo, se evita la comunicación entrecruzada no deseada de la muestra con los pocillos de muestras circundantes en que la reacción de la luciferasa no se ha iniciado aún. Se da a conocer un experimento en que se permite que la luciferasa Renilla reaccione con coelenterazina, después de lo cual se añade NaI como agente desactivador. De este modo, a diferencia de la presente invención en la que se inicia una reacción de la luciferasa mediante la combinación de la muestra y un sustrato en presencia de una fuente de yoduro, en el método de la técnica anterior el yoduro añadido a la muestra por separado del sustrato después de la medición de la luminiscencia producida. El yoduro está ausente durante la fase de inicio e incubación de la reacción de la luciferasa. En otro ejemplo, el documento WO96/4098 da a conocer el inicio de una reacción de la luciferasa utilizando un reactivo que comprende coelenterazina y una fuente de yoduro. Es una solución de sustrato de Renilla que comprende Na4PPi 15 mM (pH 5, 5) y bencil coelenterazina 2 !M en combinación... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de la actividad de luciferasa en una muestra que comprende luciferasa utilizando coelenterazina o un análogo de la misma como sustrato, que comprende:

a) iniciar la producción de luminiscencia catalizada por luciferasa mediante el contacto de dicha muestra con un reactivo de detección de luciferasa para producir una mezcla de reacción, comprendiendo dicho reactivo coelenterazina y, como mínimo, una fuente de yoduro en una cantidad suficiente para generar yoduro de 0, 02 a 100 mM, b) incubar dicha mezcla de reacción bajo condiciones adecuadas para producir luminiscencia, y c) medir la luminiscencia producida.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha, como mínimo, una fuente de yoduro es una sal de yoduro, preferentemente seleccionada del grupo que comprende Nal, KI, LiI y NH4I, o cualquier combinación de las mismas.

3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que la coelenterazina se selecciona del grupo que comprende coelenterazina nativa, coelenterazina cp, coelenterazina f, coelenterazina fcp, coelenterazina h, coelenterazina hcp, coelenterazina i, coelenterazina ip y coelenterazina n.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la coelenterazina o un análogo de la misma está presente en la mezcla de reacción en una concentración de 2-5 !M, preferentemente en una solución tampón de EDTA 1-10 mM que tiene un pH entre 7, 2-8, 0.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de reacción comprende yoduro de 1 mM a 100 mM.

6. Kit de ensayo para detector luciferasa en una muestra que comprende un primer recipiente que comprende un reactivo de detección de luciferasa que comprende coelenterazina o un análogo de la misma en combinación con, como mínimo, una fuente de yoduro en una cantidad suficiente para generar de 0, 02 a 100 mM de yoduro, en el que dicho reactivo no comprende una luciferasa, y un segundo recipiente que comprende otro componente útil para el ensayo, tal como un reactivo tampón o un patrón de luciferasa, y/o instrucciones para utilizar el kit.

7. Kit, según la reivindicación 6, en el que la coelenterazina se selecciona del grupo que comprende coelenterazina nativa, coelenterazina cp, coelenterazina f, coelenterazina fcp, coelenterazina h, coelenterazina hcp, coelenterazina i, coelenterazina ip y coelenterazina n.

8. Kit, según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicha, como mínimo, una fuente de yoduro es una sal de yoduro, preferentemente seleccionada del grupo que comprende NaI, KI, LiI, y NH4I.

9. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que dicho reactivo de detección de luciferasa comprende, como mínimo, una fuente de yoduro en una cantidad de 1 a 100 mM.

10. Utilización de una fuente de yoduro para reducir la autoluminiscencia de la coelenterazina o un análogo de la misma para mejorar la sensibilidad de detección en un sistema de ensayo de bioluminiscencia que utiliza coelenterazina o un análogo de la misma como sustrato.

11. Utilización, según la reivindicación 10, en la que la fuente de yoduro es una sal de yoduro, preferentemente seleccionada del grupo que comprende NaI, KI, LiI, y NH4I o cualquier combinación de las mismas.

12. Utilización, según la reivindicación 10 u 11, en la que la coelenterazina se selecciona del grupo que comprende coelenterazina nativa, coelenterazina cp, coelenterazina f, coelenterazina fcp, coelenterazina h, coelenterazina hcp, coelenterazina i, coelenterazina ip y coelenterazina n.

13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que dicha fuente de yoduro se utiliza en una cantidad suficiente para generar yoduro de 0, 02 a 500 mM.

14. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para mejorar la sensibilidad de detección en un sistema de ensayo de luciferasa.

15. Utilización, según la reivindicación 14, en la que dicha luciferasa es luciferasa Renilla, Gaussia, Metridia u Obelia.