MÉTODOS PARA LA DEPOSICIÓN PROGRESIVA DE RECUBRIMIENTOS DE FIBROÍNA DE SEDA.

Métodos para la deposición progresiva de recubrimientos de fibroína de seda Campo de la invención La invención se refiere en general a métodos para preparar recubrimientos de biomaterial de seda con disoluciones de fibroína de seda en las que el grosor y la estructura del recubrimiento de biomaterial pueden controlarse. También se describen composiciones farmacéuticas y dispositivos médicos recubiertos. Antecedentes de la invención Hay una necesidad crítica en el campo de la ciencia de biomateriales de desarrollar métodos sencillos para el ensamblaje de recubrimientos de biomaterial controlados, biocompatibles y funcionalizados. Se han desarrollado numerosas técnicas de modificación con el objetivo de confeccionar una superficie del material con biocompatibilidad y bioactividad deseadas, incluyendo el injerto químico de grupos funcionales y la fisisorción de moléculas específicas. Mientras que estos métodos son eficaces para necesidades específicas, también presentan limitaciones con respecto a la complejidad del procesamiento, la pérdida de bioactividad de las biomoléculas que van a suministrarse y el control limitado de la biodegradación. La técnica de ensamblaje capa a capa (layer-by-layer, LbL) ofrece una estrategia alterna para formar recubrimientos de superficie biofuncionalizados. La LbL tradicional que Iler y Decher et al. (Iler, R.K. J. Colloid Interface Sci., 1966, 21, 569-594; Decher, et al Thin Solid Films, 1992, 210/211, 831-835; Decher, G. Science, 1997, 277, 1232-1237) aplicaron por primera vez se basa en la deposición alterna de polielectrolitos cargados de manera opuesta, formando capas interpenetrantes de sales poliméricas. La fuerza impulsora de este ensamblaje LbL es principalmente la interacción electrostática, aunque el proceso también puede implicar interacciones de transferencia de carga, interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno e interacciones hidrófobas de corto alcance (Kotov, N.A., NanoStructured Materials, 1999,12, 789; Lojou, E.; et al, 2003, 20, 748-755). El procedimiento es fácil, barato y muy versátil. Los recubrimientos pueden formarse sobre prácticamente cualquier sustrato de casi cualquier forma y tamaño y generalmente no requieren procesamiento químico intenso. Por tanto, es posible incorporar materiales con funciones deseadas en estos recubrimientos, incluyendo fármacos farmacológicos, factores de crecimiento y proteínas de señalización (Jessel, N. et al Advanced Materials, 2003,15, 692-695). Estas funcionalidades pueden o bien ser una de las capas de polielectrolitos en el ensamblaje o bien estar atrapadas entre capas con un control a escala de nanómetros o micrómetros. Los estudios fundamentales y aplicados de recubrimientos LbL en cuanto a aplicaciones biológicas incluyen la fabricación de películas diseñadas para promover o inhibir la unión de células (Elbert, D.L. et al. Langmuir, 1999, 15, 5355-5362; Serizawa, T. et al, Biomacromolecules, 2002, 3, 724-731), la inmovilización de células vivas (Chluba, J. et al. Biomacromolecules, 2001, 2, 800-805; Grant, G. G. S. et al. Biomed. Microdevices, 2001, 4, 301-306), la inmovilización de enzimas activas (Jin, W. et al. Chem. Soc. 2001, 123, 8121-8122; Lvov, Y. et al. Nano Lett. 2001, 1, 125-128; Tiourina, O. P. et al. Macromol. Biosci. 2001, 1, 209-214) y la liberación sostenida de ADN funcional (Zhang, J. T. et al. Langmuir, 2004, 20, 8015-8021). En la última década, el uso de fibroína de seda como biomaterial se ha ampliado a estudios in vitro e in vivo debido a la combinación única de propiedades biocompatibles y estructurales mecánicas presentadas por esta proteína (Sakabe, H. et al. Sen-i Gakkaishi, 1989, 45, 487-490; Park, W. H. et al. Fibers Polym, 2001, 2, 58-63; Santin, M. et al. J Biomed Mater Res., 1999, 46, 382-389). Estudios exhaustivos de las propiedades mecánicas y la respuesta inflamatoria sugieren que la fibroína de seda como una importante opción de material en los campos de liberación controlada, biomateriales y armazones (Meinel, L. Hofmann, et al. Biomaterials, 2005, 26, 147-155). Se ha procesado satisfactoriamente fibroína de seda regenerada para dar películas, geles, esterillas de fibras electrohiladas y armazones porosos tridimensionales (Min, B.-M. et al. Biomaterials, 2004, 25, 1289-1297; Kim, H. J. et al. Biomaterials, 2005, 26, 4442-4452). Además, se han optimizado recientemente disoluciones acuosas de estas proteínas (Kim, U. J. Biomaterials, 2005, 26, 2775-2785). Sin embargo, aunque se ha demostrado que los materiales de fibroína de seda tienen un potencial prometedor, sigue por determinarse un medio para controlar adecuadamente el ensamblaje de recubrimientos de fibroína de seda. La capacidad para controlar la formación de recubrimientos de seda que tienen propiedades especificadas incluyendo grosor, química de superficie y estructura definidos es importante para funcionalizar superficies de biomateriales a base de proteína para aplicaciones tales como recubrimientos de dispositivos médicos y armazones de ingeniería de tejidos. Además, un procedimiento de ensamblaje estrechamente controlado es una necesidad clara para el desarrollo de productos farmacéuticos, por ejemplo biomateriales de liberación controlada. Además, procesos que pueden funcionar en un modo de todo agua ofrecen importantes beneficios a la conservación de la función de compuestos sensibles, células u otros componentes que pueden atraparse o arrastrarse en las capas o los dispositivos. 2   Sumario de la invención La presente invención proporciona métodos para el ensamblaje controlado de películas estratificadas de fibroína de seda. Análogos a las técnicas LbL tradicionales, los métodos de la invención permiten el control de la química de superficie, el grosor, la morfología y la estructura de recubrimientos de película delgada o recubrimientos a granel, así como la inclusión de componentes biológicos lábiles, fármacos, citocinas, ADN y células o virus para generar recubrimientos funcionales. Los métodos descritos en el presente documento proporcionan un avance importante con respecto al estado actual de la técnica en la modificación de superficie de biomateriales porque las propiedades de los recubrimientos de fibroína de seda a nanoescala pueden controlarse y los recubrimientos pueden formarse sobre prácticamente cualquier sustrato de cualquier material, forma o tamaño. Además, los métodos pueden realizarse en todo agua y no requieren procesamiento químico intenso permitiendo el atrapamiento controlado de moléculas lábiles. Además, a diferencia de las técnicas LbL tradicionales que requieren cargas apropiadas o grupos funcionales para la acumulación de los recubrimientos, el control estructural de la proteína de seda garantiza las características de los recubrimientos debido a reticulación física (láminas beta), dando como resultado un material robusto y estable que no requiere ninguna reacción de reticulación electromagnética o química específica, mejorando adicionalmente la estabilidad de las moléculas atrapadas o los componentes sensibles. Se proporciona un método para preparar un recubrimiento de biomaterial de seda estratificado sobre un sustrato. El método comprende, a) poner en contacto un sustrato con una disolución de fibroína de seda de manera que la disolución forma una primera capa sobre el sustrato, se prefiere una disolución de fibroína de seda acuosa, b) deshidratar dicha capa mediante la exposición de la capa a un flujo de gas de deshidratación, c) poner en contacto la primera capa deshidratada con una disolución de fibroína de seda de manera que la disolución forma una segunda capa sobre la primera capa deshidratada, d) deshidratar dicha segunda capa mediante la exposición de la segunda capa a un flujo de gas de deshidratación; y repetir las etapas c) y d) hasta que se deposita el número deseado de capas sobre el sustrato dando como resultado un recubrimiento estratificado sobre dicho sustrato. En una realización preferida, al menos un agente contiene un agente bioactivo, por ejemplo, un agente terapéutico. Una o más capas que no contienen agente bioactivo añadido (capa de barrera) pueden depositarse sobre las capas que contienen el agente bioactivo para controlar la liberación y/o limitar el aumento súbito inicial del agente. En una realización cada capa se lava con agua, preferiblemente desionizada, antes de la deshidratación. Las capas también pueden lavarse con una disolución de metanol o una disolución de agua/metanol. En una realización preferida el gas usado para la deshidratación es gas nitrógeno (N2), sin embargo, cualquier gas con propiedades deshidratantes, tal como CO2 o aire caliente, puede usarse para secar/deshidratar las capas. El método de la invención permite controlar el grosor de cada capa depositada. Además, cada una de las etapas para... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar un recubrimiento de biomaterial de seda sobre un sustrato que comprende: a. poner en contacto un sustrato con una disolución de fibroína de seda acuosa de manera que la disolución forma una primera capa sobre el sustrato; b. deshidratar dicha primera capa mediante la exposición de la primera capa a un flujo de gas de deshidratación; c. poner en contacto la primera capa deshidratada con una disolución de fibroína de seda de manera que la disolución forma una segunda capa sobre la primera capa deshidratada, d. deshidratar dicha segunda capa mediante la exposición de la segunda capa a un flujo de gas de deshidratación; y e. repetir las etapas c) y d) hasta que se deposita el número deseado de capas sobre el sustrato dando como resultado un recubrimiento estratificado sobre dicho sustrato. 2. Método según la reivindicación 1, en el que cada capa se lava con agua antes de la deshidratación. 3. Método según la reivindicación 2, en el que el agua comprende además metanol o una disolución,, tratamiento o material que induce la pérdida de agua del recubrimiento. 4. Método según la reivindicación 1, en el que el gas de deshidratación es gas nitrógeno (N2). 5. Método según la reivindicación 1, en el que el gas de deshidratación es aire caliente. 6. Método según la reivindicación 1, en el que la tasa de degradación del recubrimiento se controla ajustando la cantidad de hidratación en cada capa aumentado o disminuyendo la cantidad de tiempo que se expone la capa al gas de deshidratación. 7. Método según la reivindicación 1, en el que la tasa de degradación del recubrimiento se controla ajustando el grosor y/o la estructura de cada capa. 8. Método según la reivindicación 1, en el que el grosor de cada capa depositada se controla controlando la concentración de sal en la disolución de fibroína de seda usada para formar la capa, en el que la concentración de sal aumenta con el fin de favorecer la deposición de fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada cuando dicho sustrato o dicha capa deshidratada es hidrófoba; y en el que la concentración de sal disminuye con el fin de favorecer la deposición de fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada cuando dicho sustrato o dicha capa deshidratada es hidrófila. 9. Método según la reivindicación 1, en el que el grosor de cada capa depositada se controla controlando la concentración de fibroína en la disolución de fibroína de seda usada para formar la capa, de manera que la concentración de fibroína en la disolución de fibroína de seda aumenta para favorecer la deposición de fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada. 10. Método según la reivindicación 1, en el que el grosor de cada capa depositada se controla controlando el pH de la disolución de fibroína de seda usada para formar la capa, de manera que cuando el sustrato es un sustrato cargado negativamente, el pH de la disolución de fibroína de seda se reduce con el fin de favorecer la deposición de la fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada; y cuando el sustrato es un sustrato cargado positivamente, el pH de la disolución de fibroína de seda se aumenta con el fin de favorecer la deposición de la fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada. 11. Método según la reivindicación 3, en el que el grosor de cada capa depositada se controla controlando la razón de metanol con respecto a agua usada en el lavado de cada capa antes de la deshidratación de cada capa, en el que un contenido en metanol superior favorece la deposición de la fibroína de seda sobre dicho sustrato o sobre la capa deshidratada. 12. Método según la reivindicación 1, en el que el grosor de al menos una capa oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 nanómetros. 13. Método según la reivindicación 1, en el que el grosor de al menos una capa oscila entre aproximadamente 50-5.000 nanómetros. 14. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un dispositivo biomédico. 19   15. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un biomaterial. 16. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un biosensor. 17. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un armazón de ingeniería de tejidos. 18. Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un objeto de plástico, madera, vidrio, cerámica, cuero, tela, sintético o metal. 19. Método según la reivindicación 1, en el que la disolución de fibroína de seda comprende además un material bioactivo. 20. Método según la reivindicación 19, en el que el material bioactivo es una célula. 21. Método según la reivindicación 19, en el que el material bioactivo es un virus. 22. Método según la reivindicación 19, en el que el material bioactivo es un metal. 23. Método según la reivindicación 19, en el que el material bioactivo es un agente terapéutico. 24. Método según la reivindicación 19, que comprende además poner en contacto el sustrato con una disolución de fibroína de seda acuosa que no contiene material bioactivo añadido. 25. Formulación farmacéutica para la liberación controlada de al menos un agente terapéutico, producido mediante el método según la reivindicación 1. 26. Formulación farmacéutica según la reivindicación 25, en la que el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un péptido, ácido nucleico, PNA, aptámero, anticuerpo y molécula pequeña. 27. Sustrato que comprende un recubrimiento de biomaterial de fibroína de seda estratificado que comprende una pluralidad de capas de fibroína de seda, en el que cada capa es de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 nm de grosor. 28. Sustrato según la reivindicación 27, en el que al menos una capa del recubrimiento comprende un material bioactivo. 29. Sustrato que comprende un recubrimiento de biomaterial de fibroína de seda que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 nm de grosor, en el que el recubrimiento comprende un material bioactivo. 30. Sustrato según la reivindicación 28 o la reivindicación 29, que comprende además un recubrimiento de biomaterial de fibroína de seda sobre la capa que contiene el material bioactivo. 31. Sustrato recubierto producido mediante el método según la reivindicación 1. 32. Sustrato según la reivindicación 31, siendo el sustrato una endoprótesis, sutura, malla, placa, tornillo, catéter, tubo, gel, armazón poroso tridimensional o armazón de ingeniería de tejidos. 33. Sustrato según la reivindicación 28 o la reivindicación 29, en el que el material bioactivo es una célula. 34. Sustrato según la reivindicación 28 o la reivindicación 29, en el que el material bioactivo es un virus. 35. Sustrato según la reivindicación 28 o la reivindicación 29, en el que el material bioactivo es un metal. 36. Sustrato según la reivindicación 28 o la reivindicación 29, en el que el material bioactivo es un agente terapéutico.   21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34