Método para analizar una región de moléculas de ADN de analito,

que comprende:

amplificar una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de alta fidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones;

formar microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo, en el que las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador para amplificar el conjunto de primeros amplicones;

amplificar los primeros amplicones en las microemulsiones, mediante lo cual se forman perlas de producto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones;

romper las microemulsiones;

amplificar los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para formar terceros amplicones; y analizar los terceros amplicones.

Métodos mejorados para BEAMING

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere al área de bioquímica analítica y diagnóstico. En particular, se refiere a detectar diferencias sutiles y raras en moléculas de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

La probabilidad de curar cánceres, a través de cirugía sola, es alta en aquellos individuos cuyos tumores primarios se detectan en un estadio relativamente temprano. Tal detección temprana es por tanto uno de los enfoques más prometedores para limitar la morbimortalidad del cáncer en el futuro (1) . En la actualidad, puede usarse la prueba de Papanicolau para detectar cánceres de cuello uterino, la mamografía puede detectar cánceres de mama, los niveles de PSA sérico pueden significar la presencia de cáncer de próstata y la colonoscopia y pruebas de sangre oculta en heces pueden detectar cánceres de colon (2) . Sin embargo, problemas de sensibilidad, especificidad, costes o cumplimiento han complicado la puesta en práctica generalizada de estas pruebas (3-5) . Además, no están aún disponibles métodos para la detección temprana de la mayoría de otros tipos de cáncer.

El descubrimiento de las bases genéticas de la neoplasia ha conducido a nuevos enfoques para detectar tumores de manera no invasiva (6-8) . Muchos de estos enfoques se basan en la detección ex vivo de formas mutantes de los oncogenes y genes supresores de tumores que son responsables del inicio y progresión de los tumores. Este enfoque se usó por primera vez para detectar tumores de vejiga y colon a través del examen de orina y deposiciones, respectivamente (9, 10) , y se ha usado desde entonces para detectar varios otros tipos de tumores (11-14) . Ya que los genes mutantes no sólo son "marcadores" para el cáncer, sino que son las causas directas de crecimiento tumoral (1) , tienen ventajas conceptuales importantes con respecto a marcadores convencionales tales como sangre oculta en heces y PSA sérico. En particular, los marcadores convencionales no están implicados patogénicamente en el proceso tumorigénico y son mucho menos específicos para la neoplasia que las mutaciones.

La evaluación de muestras de sangre de pacientes para detectar moléculas de ADN mutante es un enfoque particularmente atractivo ya que tales pruebas podrían detectar muchas formas de cánceres diferentes. Adicionalmente, puede obtenerse fácilmente sangre de pacientes durante las visitas ambulatorias de rutina y se conocen bien métodos para preparar y almacenar plasma y suero y son fiables. Por consiguiente, numerosos estudios han intentado identificar formas o cantidades anómalas de ADN en plasma o suero (6, 11-15) . Desafortunadamente, los resultados de muchos de estos estudios son contradictorios. Algunos notifican altas tasas de detección de cánceres, otros muy bajas, a pesar del uso de cohortes de pacientes y técnicas similares. Además, varios estudios han mostrado que la pérdida de heterocigosidad puede detectarse de manera rutinaria en ADN circulante, incluso en pacientes con tumores relativamente no agresivos. Para detectar la pérdida de heterocigosidad en tales muestras, las células neoplásicas dentro de un tumor deben contribuir a más del 50% del ADN circulante total.

Los estudios anteriores, aunque prometedores, conducen a varias cuestiones que deben responderse para generar confianza en el uso de ADN anómalo, circulante como biomarcador de tumores malignos. En primer lugar, cuántas copias de un fragmento génico dado están presentes en la circulación en pacientes con cáncer? En segundo lugar, cuál es la naturaleza de este ADN, por ejemplo, intacto frente a degradado? En tercer lugar, qué fracción de estos fragmentos génicos tienen una secuencia de ADN anómala (por ejemplo, mutante) ? Y en cuarto lugar, cómo varía esta fracción con el estadio de la enfermedad? Para responder a estas cuestiones, es necesario desarrollar tecnologías que puedan cuantificar simultáneamente el número de moléculas de ADN normales y mutantes en una muestra dada, incluso cuando la fracción de moléculas mutantes es muy pequeña. Tales ensayos sensibles y precisos para la detección y cuantificación de variantes raras entre un gran exceso de secuencias normales tienen aplicaciones importantes en muchas áreas de investigación biomédica. Los ejemplos en la investigación científica básica incluyen el análisis de la fidelidad de replicación en diversos sistemas in vitro y la determinación de las tasas de mutación en células tras el tratamiento con mutágenos. Los ejemplos en la medicina clínica incluyen la identificación de mutaciones en la sangre, la orina o las deposiciones de pacientes con cáncer y la identificación de secuencias de ADN fetal en el plasma de mujeres embarazadas.

Dressmen et al. dan a conocer un enfoque, denominado BEAMing (perlas, emulsiones, amplificación e imanes) , que permite la transformación de una población de fragmentos de ADN en una población de perlas que contienen cada una miles de copias de la secuencia idéntica. Se ha mostrado que la población de perlas generadas de este modo representa de manera precisa la población de ADN inicial. Debido a que pueden generarse 108 perlas en un único tubo de ensayo y analizarse mediante citometría de flujo convencional, esta técnica tiene la capacidad de no sólo identificar variaciones genéticas presentes en la población de ADN original, sino también cuantificar de manera precisa su número en comparación con secuencias de tipo natural. Además de su uso para descubrir tales variantes raras, las perlas generadas a través del procedimiento de BEAMing proporcionan moldes excelentes para la secuenciación de nucleótidos, por ejemplo, secuenciación mediante síntesis. Las perlas también pueden usarse como moldes para ambos métodos de alto rendimiento recientemente descritos para este fin.

Las ventajas de tener tantas copias como sea posible por perla para aplicaciones tanto de citometría de flujo como de secuenciación son claras. Se estima que el número de copias por perla de 1 micrómetro producidas mediante BEAMing es de 104 - 105. Hay una necesidad en la técnica de una técnica que pueda aumentar este número en al menos dos órdenes de magnitud. Thomas et al. dan a conocer el uso de amplificación por círculo rodante en cascada para amplificar sondas de candado circularizadas mediante un mecanismo que combina la replicación por círculo rodante con la síntesis de desplazamiento de hebra. El documento US 2005/0227264 da a conocer métodos para amplificar material genético usando una emulsión de agua en aceite en un flujo continuo. La emulsión incluye una pluralidad de gotitas de agua que comprenden microrreactores para amplificar una o más especies de moldes de ácido nucleico. La emulsión se procesa térmicamente haciéndola fluir por zonas de temperatura controlada estacionaria para amplificar los moldes de ácido nucleico mediante PCR. El documento WO 03/106678 da a conocer un método de realización de una reacción química introduciendo una primera fase discontinua que comprende al menos uno de los reactantes en una segunda fase continua formando una emulsión, sometiendo la emulsión a un cambio físico o químico de manera que la primera fase discontinua coalesce para dar una fase sustancialmente continua y proporcionando condiciones en las que la reacción química puede tener lugar en la primera fase continua recién formada.

Sumario de la invención

Una realización de la invención proporciona un método para amplificar una región de moléculas de ADN de analito. Se amplifica una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de alta fidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones. Se forman microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo. Las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador para amplificar el conjunto de primeros amplicones. Los primeros amplicones se amplifican en las microemulsiones. Se forman perlas de producto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones. Se rompen las microemulsiones. Se amplifican los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para formar terceros amplicones.

Esta y otras realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras leer la memoria descriptiva que proporciona a la técnica métodos para el análisis, el diagnóstico, y la selección de diferencias en ácidos nucleicos sutiles y raras y las condiciones o agentes que provocan tales diferencias.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Efecto del tamaño de amplicón... [Seguir leyendo]

1. Método para analizar una región de moléculas de ADN de analito, que comprende:

amplificar una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de alta fidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones;

formar microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo, en el que las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador para amplificar el conjunto de primeros amplicones;

amplificar los primeros amplicones en las microemulsiones, mediante lo cual se forman perlas de producto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones;

romper las microemulsiones;

amplificar los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para formar terceros amplicones; y analizar los terceros amplicones.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación por círculo rodante emplea una sonda circularizable, comprendiendo dicha sonda una primera y una segunda región de complementariedad con una tercera y una cuarta región en dichos segundos amplicones, en el que dichas regiones primera y segunda no son contiguas en dicha sonda, y en el que dichas regiones tercera y cuarta no son contiguas en dichos segundos amplicones, en el que dichos segundos amplicones comprenden una quinta región de 130 nucleótidos entre dichas regiones tercera y cuarta, en el que tras la hibridación de la sonda circularizable con los segundos amplicones, el ligamiento dirigido por el molde de los extremos de la sonda circularizable forma un círculo.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación por círculo rodante emplea una sonda de candado, comprendiendo dicha sonda una primera y una segunda región de complementariedad con una tercera y una cuarta región en dichos segundos amplicones, en el que dichas regiones primera y segunda son contiguas en dicha sonda, y en el que dichas regiones tercera y cuarta son contiguas en dichos segundos amplicones, en el que tras la hibridación de la sonda de candado con los segundos amplicones, el ligamiento dirigido por el molde de los extremos de la sonda de candado forma un círculo.

4. Método según la reivindicación 1, en el que los terceros amplicones se analizan mediante la etapa de:

determinar una característica de secuencia de los terceros amplicones mediante extensión de una única base con al menos dos didesoxirribonucleótidos marcados de manera diferencial de un cebador unido a dichos terceros amplicones.

5. Método según la reivindicación 1, en el que se usan dos polimerasas de alta fidelidad en paralelo y se comparan para determinar su fidelidad relativa.

6. Método según la reivindicación 3, en el que el ADN de analito se ha tratado con un posible mutágeno.

7. Método según la reivindicación 4, en el que antes de la etapa de análisis, las perlas de producto se someten a condiciones de desnaturalización mediante lo cual los segundos amplicones se separan en hebras individuales, y en el que se desechan hebras individuales que no están unidas a las perlas de producto.

8. Método según la reivindicación 4, en el que antes de la etapa de análisis, las perlas de producto se incuban con desoxinucleótidos no marcados.