Un método para producir antígeno viral que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células de riñón de mono cultivadas exclusivamente en medios sin proteínas durante múltiples generaciones,

(b) infectar dicho cultivo con un virus seleccionado entre el grupo que consiste en orthomyxoviridae;y

(c) incubar dicho cultivo celular infectado con dicho virus para propagar dicho virus,

(d) retirar una parte del cultivo celular de la etapa (c);

(e) poner en contacto dicha parte del cultivo de la etapa (d) con al menos una proteasa que aumente la activación de dicho virus;

(f) añadir a dicha parte de etapa (e) al menos un compuesto que inhiba o atenúe cualquier efecto tóxico celular de dicha proteasa; y

(g) devolver dicha parte de etapa (f) a dicho cultivo.

Método para producir sustancias biológicas en cultivo sin proteínas

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de estudio para propagar un virus seleccionado entre el grupo de orthgomyxoviridae, que incluye prácticamente todos los virus Influenza, con rendimientos comparativamente altos sin la necesidad de efectuar pases en cultivo, que incluye la producción de virus reordenantes y atenuados de crecimiento alto. La presente invención proporciona además la producción de vacunas a partir de esos virus. La invención también se refiere a una biomasa celular que es capaz de soportar el cultivo de dichos virus. La presente invención también se refiere a la producción de virus, antígenos de virus y proteínas recombinantes mediante el uso de esa biomasa celular.

Antecedentes de la Invención

La producción eficaz de vacunas requiere el crecimiento de grandes cantidades de virus producidas en altos rendimientos a partir de un sistema de hospedador. Diferentes tipos de virus requieren diferentes condiciones de cultivo para obtener rendimientos aceptables. Por lo tanto, el hospedador en el que se cultiva el virus es de enorme importancia. Como una función del tipo de virus, se puede cultivar un virus en células de cultivo de tejido primario, en líneas celulares establecidas o en huevos embrionados, tales como los de pollo.

Las condiciones de cultivo en las que se cultiva una cepa de virus también son de enorme importancia con respecto a conseguir un rendimiento aceptablemente alto de la cepa. Por tanto, para maximizar el rendimiento de una cepa de virus deseada, tanto el sistema de hospedador como las condiciones de cultivo se tienen que adaptar específicamente para proporcionar un entorno que sea provechoso para la producción de una cepa de virus deseada. Por lo tanto, para conseguir un rendimiento aceptablemente alto de las diversas cepas de virus, se requiere un sistema que proporcione condiciones de cultivo óptimas para un gran número de virus diferentes. Muchos virus están limitados a sistemas de hospedador muy específicos, algunos de los cuales son muy ineficaces con respecto a rendimientos de virus.

Algunas de las células de mamífero que se usan como sistemas de hospedador virales producen virus en rendimientos altos, pero la naturaleza tumorígena de tales células implica restricciones reguladoras contra su uso para producción de vacunas. De hecho, las directrices aplicables de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que sólo se permiten unas pocas líneas celulares para la producción de vacunas de virus.

Los problemas que surgen a partir del uso de suero en cultivo de células y/o aditivos de proteína obtenidos a partir de una fuente animal o de humano añadidos al medio de cultivo, es decir, la calidad y composición variable de lotes diferentes y el riesgo de contaminación con micoplasma, virus o agente de BSE, son bien conocidos. En general, el suero o sustancias obtenidas de suero como albúmina, transferrina o insulina pueden contener agentes indeseados que pueden contaminar el cultivo y los productos biológicos producidos a partir del mismo. Adicionalmente, los aditivos obtenidos de suero de humano se tienen que ensayar para determinar todos los virus conocidos, como hepatitis o VIH, que se pueden transmitir por suero. El suero bovino y los productos obtenidos del mismo, por ejemplo tripsina, conllevan el riesgo de contaminación con BSE. Además, todos los productos obtenidos de suero se pueden contaminar con agentes aún desconocidos. Por lo tanto, se están realizando muchos intentos para proporcionar sistemas de hospedador eficaces y condiciones de cultivo que no requieran suero u otros compuestos obtenidos de suero.

A lo largo del tiempo, muchos virus cambian sus serotipos. Cualquier cambio en el serotipo de virus requiere un cambio correspondiente en una vacuna que tiene por objeto provocar inmunidad hacia el nuevo serotipo de virus. Para mantener la eficacia de la protección aportada por una vacuna a un nuevo serotipo de virus particular, se tiene que producir una nueva vacuna que confiera inmunidad para ese nuevo serotipo. Para producir la nueva vacuna, las cepas de virus nuevas se tienen que cultivar. Debido a que muchos virus, en particular virus Influenza, cambian de serotipo muy rápidamente, el sistema de cultivo tiene que ser capaz de producir antígeno viral, incluyendo viriones, en cantidades a gran escala lo suficientemente rápido para permitir producción de vacunas durante la temporada de infección del virus.

En muchos casos, las condiciones de cultivo óptimas para las nuevas cepas de virus son diferentes de las condiciones empleadas para cultivar sus predecesores. Por consiguiente, es altamente deseable un sistema de cultivo que se pueda ajustar fácilmente para proporcionar los requerimientos para crecimiento óptimo de nuevas cepas de virus. Además, consideraciones prácticas, tales como la necesidad de rendimiento alto de producción de la nueva cepa, vuelven altamente deseable un método que es aplicable a producción a gran escala del virus, tal como Influenza.

Un ejemplo típico de un virus que cambia su serotipo frecuentemente es el virus Influenza. Influenza es una enfermedad respiratoria grave en el hombre y es responsable de muchas miles de muertes cada año.

Existen tres tipos generales de virus Influenza, Tipo A, Tipo B y Tipo C. Los tipos se caracterizan por la ausencia de reactivad cruzada serológica entre sus proteínas internas. Los virus Influenza de Tipo A se clasifican adicionalmente en subtipos basándose en diferencias antigénicas de sus glicoproteínas, las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) . Los seres humanos son susceptibles principalmente a enfermedades causadas por infección con virus Influenza de Tipo A, B y C.

Actualmente, los casos más significativos de infecciones de Influenza en seres humanos son los que se atribuyen al Tipo B y a los subtipos H1N1 y H3N2 de Influenza Tipo A. Por consiguiente, los antígenos de Tipo B y de subtipos H1N1 y H3N2 de Influenza Tipo A son aquellos que se incorporan generalmente en las vacunas de Influenza actuales. Las vacunas disponibles actualmente tienen índices de protección que varían del 75-90%.

El antígeno HA de Influenza es la diana principal para las respuestas inmunes protectoras de un hospedador hacia el virus. Uno de los problemas en el desarrollo de vacunas de Influenza eficaces proviene del alto índice de mutación del gen que codifica la proteína HA, dando como resultado cambios frecuentes en su antigenicidad. Por lo tanto, para producir vacunas eficaces, se tienen que producir frecuentemente nuevas vacunas a partir de aislados de Influenza recientes.

La práctica habitual de recuperar nuevos aislados virales implica recuperación con un frotis de garganta o fuente similar, seguido de cultivo de los aislados en huevos de pollo embrionados. Aunque el aislamiento inicial en huevos puede ser difícil, el virus se adapta a su hospedador de huevo y se puede llevar a cabo producción a gran escala del virus en huevos.

Los métodos convencionales para producir vacuna de influenza siempre han implicado el cultivo de los virus en huevos de pollo embrionados. Después, los virus cultivados mediante este método se usan para producir vacunas de virus atenuado vivo, virus entero muerto o de subunidad. Sin embargo, la metodología convencional que implica huevos de pollo embrionados para producir vacunas de influenza es extremadamente engorrosa, implicando el manejo de muchos miles de huevos por semana. En una operación típica, los huevos se tienen que mirar al trasluz, se tiene que esterilizar la cáscara y cada huevo se tiene que inocular mediante inyección de un volumen pequeño de virus en la cavidad alantoidea. Después, los huevos inyectados se incuban durante 48-72 horas a 33º -37º C, se miran de nuevo al trasluz, se refrigeran durante la noche y se abren para permitir recolección del líquido alantoideo. Después, el líquido recolectado se tiene que aclarar mediante filtración y/o centrifugación antes de procesarse para purificación adicional. Después se requiere la purificación exhaustiva para asegurar la liberación a partir de la proteína del huevo. Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966) .

En una operación típica de embriones de pollo, se requieren entre uno y dos huevos para producir una dosis de vacuna de influenza. Por tanto, para producir un millón de dosis de vacuna, se tienen que procesar más de un millón de embriones de huevo.... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir antígeno viral que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células de riñón de mono cultivadas exclusivamente en medios sin proteínas durante múltiples generaciones,

(b) infectar dicho cultivo con un virus seleccionado entre el grupo que consiste en orthomyxoviridae;y

(c) incubar dicho cultivo celular infectado con dicho virus para propagar dicho virus,

(d) retirar una parte del cultivo celular de la etapa (c) ;

(e) poner en contacto dicha parte del cultivo de la etapa (d) con al menos una proteasa que aumente la activación de dicho virus;

(f) añadir a dicha parte de etapa (e) al menos un compuesto que inhiba o atenúe cualquier efecto tóxico celular de dicha proteasa; y

(g) devolver dicha parte de etapa (f) a dicho cultivo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus se propaga sin pases en cultivo en serie múltiples del mismo a través de dicho cultivo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho virus es un virus Influenza A, B o C.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho virus Influenza se ha alterado para modificar un sitio de escisión o para crear un nuevo sitio de escisión en la hemaglutinina.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 4, en el que dichas células de riñón de mono se seleccionan entre el grupo que consiste en células VERO, células CV-1 y células LLC-MK2.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho cultivo de células de riñón de mono es una biomasa celular de células VERO.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha proteasa es de una fuente procariota.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en pronasa, termolisina y subtilisina A.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha proteasa está en un recipiente o está inmovilizada en un vehículo.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho compuesto que inhibe o atenúa cualquiera de los efectos tóxicos celulares de dicha proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en inhibidor de tripsina de soja, inhibidor de tripsina de huevo y aprotinina.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho compuesto que inhibe o atenúa cualquiera de los efectos tóxicos celulares de dicha sustancia está en un recipiente o está inmovilizada en un vehículo.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas (a) - (d) se realizan en un primer recipiente y las etapas (e) y (f) se realizan en un segundo recipiente.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho primer recipiente y dicho segundo recipiente están conectados en un bucle de forma que las etapas (a) - (g) de puedan realizar de una manera cíclica.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas (a) a (d) se realizan en un primer recipiente, la etapa (e) se realiza en un segundo recipiente y la etapa (f) se realiza en un tercer recipiente.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que en el que dicho primer recipiente, dicho segundo recipiente y dicho tercer recipiente están conectados en un bucle de forma que las etapas (a) - (g) de puedan realizar de una manera cíclica.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que las etapas (a) - (g) se realizan de manera discontinua.

17.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo además las etapas de:

(h) supervisar los niveles de crecimiento, infección y activación de dicho cultivo; y

(i) variar las condiciones de dicho cultivo para maximizar los niveles de crecimiento, infección y activación.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, comprendiendo además la etapa de 5 recolectar dicho virus o antígeno viral de dicho cultivo.

19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, comprendiendo además la etapa de preparar una vacuna con dicho virus o antígeno viral recolectado.

20. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos seis, preferentemente durante al menos doce generaciones.

21. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos dieciocho generaciones.

22 .El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células se cultivan en la etapa (a) durante al menos veinticuatro generaciones.