Método para identificar inhibidores de ácido lipoteicoico sintasa.

Un metodo para identificar un inhibidor de LtaS que comprende:

(a) proporcionar bacterias gram positivas en las que las bacterias comprenden una mutacion en el gen mbl uhomologo del mismo que altera la funcion del gen mbl u homologo del mismo;

(b) cultivar las bacterias de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menorde 3 mM;

(c) supervisar el crecimiento de las bacterias;

en el que el crecimiento o crecimiento mas rapido de las bacterias en comparacion con crecimiento en ausencia dela sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS.

Método para identificar inhibidores de ácido lipoteicoico sintasa

Campo de la invención La invención se refiere a métodos o ensayos para identificar agentes que pueden usarse como agentes antibacterianos, por ejemplo, como antibióticos.

Antecedentes de la invención Se ha mostrado recientemente que el ácido lipoteicoico (LTA) es esencial para la viabilidad de Staphylococcus aureus. También se ha descrito una enzima responsable del ensamblaje de LTA en S. aureus. Esta enzima se ha nombrado ácido lipoteicoico sintasa, LtaS. Véase Gründling y Schneewind, 2007, PNAS 104: 8478-8483.

También existen homólogos de LtaS en otras bacterias. Por ejemplo, las cepas de Bacillus expresan un homólogo, previamente denominado yflE. Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente) demostraron que el homólogo de ltaS de Bacillus subtilis puede restaurar la síntesis de LTA y el crecimiento de estafilococos mutantes para ltaS. La inhibición de ltaS puede usarse por lo tanto como una diana para tratar infecciones humanas provocadas por S. aureus u otros patógenos bacterianos. Aunque Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente) sugieren que LtaS podría ser una diana útil para la identificación de inhibidores que podrían usarse como compuestos antibacterianos, no se sugiere ningún método de ensayo específico. El ensayo usado por Gründling y Schneewind para encontrar el gen ltaS no sería fácilmente adaptable para exploración de compuestos.

En consecuencia, existe la necesidad de un ensayo para identificar inhibidores de LtaS.

Mbl es un homólogo de actina bacteriano que se cree que tiene un papel en la determinación de la forma celular situando la maquinaria sintética de la pared celular. También se cree que está implicado en el control de otras funciones incluyendo pluralidad celular y segregación de cromosomas en diversos organismos. Bacillus subtilis y muchas otras bacterias gram positivas tienen tres isoformas de actina, una de las cuales es Mbl, que se localiza conjuntamente con otras dos isoformas de actina MreB y MreBH en estructuras helicoidales que abarcan la longitud de la célula, cerca de la superficie interna de la membrana citoplasmática.

Estudios llevados a cabo con Bacillus subtilis han mostrado que los mutantes del gen mbl son inviables a niveles de Mg2+ normales. La aportación de altas concentraciones de Mg2+, por ejemplo, 20 mM, rescata tales cepas de Bacillus. Véase Carballido-López et al., 2006, Developmental Cell 11, 399-409.

Sumario de la invención Los presentes inventores han identificado que la mutagénesis de transposón puede rescatar mutantes de mbl. En particular, las cepas de Bacillus que comprenden mutaciones de mbl pueden someterse a mutagénesis de transposón y sembrarse en placas en un medio de Mg2+ bajo para identificar y seleccionar mutaciones supresoras que permitan el crecimiento de las bacterias. El análisis de los mutantes de transposón identificó que la inactivación del gen ltaS provoca rescate de mutantes de mbl de modo que tales cepas puedan crecer en condiciones de Mg2+

bajo. En consecuencia, los presentes inventores describen ensayos para identificar inhibidores de LtaS identificando sustancias que pueden rescatar el crecimiento de mutantes de mbl en medio de Mg2+ bajo. Estos ensayos son métodos de exploración basados en células fáciles y económicos que posibilitan la exploración de un gran número de compuestos de una manera sencilla.

Por lo tanto, de acuerdo con los primeros aspectos de la presente invención, se proporciona un método para identificar un inhibidor de LtaS que comprende:

(a) proporcionar una bacteria gram positiva que comprende una mutación en el gen mbl u homólogo del mismo que interrumpe la función del gen mbl u homólogo del mismo;

(b) cultivar la bacteria de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menor de 3 mM;

(c) supervisar el crecimiento de las bacterias;

en el que en el crecimiento o el crecimiento más rápido de las bacterias en comparación con crecimiento en ausencia de la sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS.

Descripción de las figuras Figura 1 -B. subtilis Δmbl depende de Mg2+

A. Eficacia de siembra después de transformación seleccionando deleción de mbl con (izquierda) y sin (derecha) adición de Mg2+ 20 mM. B. Curva de crecimiento de B. subtilis de tipo silvestre (triángulos) y mutante de mbl

(cuadrados) a 37 ºC en medio PAB sin (símbolos cerrados) y con (símbolos abiertos) adición de Mg2+ 20 mM. C-E. Morfología (microscopía de contraste de fases) de B. subtilis Δmbl cultivado en PAB (C) o en PAB complementado con Mg2+ 20 mM (D) en comparación con una cepa de tipo silvestre cultivada en PAB (E) . Barra de escala 5 μm.

Figura 2 -La deleción de ltas suprime la dependencia de Mg2+ de mutantes de mbl:

A. Crecimiento de tipo silvestre (168) , mutante de mbl (2505) , mutante de ItaS (4283) y mutante de mbl suprimido (Δmbl ΔltaS, 4298) en placas NA con (izquierda) o sin (derecha) adición de Mg2+ 20 mM. B. Curvas de crecimiento de tipo silvestre (168, ♦) , mutante de mbl (2505, ■) , mutante de ltaS (4283, A) y mutante de mbl suprimido (Δmbl

ΔltaS, 4298, O) en medio PAB a 37 ºC. C. Microscopía de contraste de fases de tipo silvestre (168) , mutante de mbl (2505) , mutante de ItaS (4283) y doble mutante de mbl ItaS (4298) cultivados en medio PAB a 37 ºC. Barra de escala 5 μm.

Figura 3 -Efecto de la concentración de iones metálicos en la viabilidad de tipo silvestre y mutantes de ltaS:

A. Crecimiento de tipo silvestre (168) y mutante de ItaS (cepa 4286) a 37 ºC en placas NA sin aditivos (izquierda) que contienen Mg2+ 0, 5 mM (medio) o con adición de Mn2+ 0, 05 mM (derecha) . B. Crecimiento de mutante de ItaS (cepa 4283, izquierda) y tipo silvestre (cepa 168, derecha) en placas de medio mínimo que contienen Mg2+ 10, 100 y 500 μM según se indica.

Descripción de las secuencias La Tabla 4 a continuación expone las secuencias de los genes como se analizan en más posteriormente.

SEC ID Nº: 1 y 2 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de yflE de Bacillus subtilis. 25 SEC ID Nº: 3 y 4 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de mbl de Bacillus subtilis.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un método para la identificación de un inhibidor de LtaS. LtaS es una ácido lipoteicoico sintasa. LtaS de Staphylococcus aureus se ha identificado en la técnica anterior y se describe por ejemplo en Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente) . También se conocen homólogos de este gen en otras cepas bacterianas. Por ejemplo, Bacillus subtilis porta un homólogo previamente identificado como yflE. La secuencia para este gen se expone en SEC ID Nº: 1 y 2.

De acuerdo con la presente invención se proporciona una cepa bacteriana de bacterias gram positivas, preferiblemente Bacillus, preferiblemente B. subtilis. La cepa bacteriana se selecciona o modifica para incluir una mutación funcional en el gen mbl de B. subtilis o un homólogo del mismo de otras bacterias gram positivas. Mbl es un homólogo de actina y se ha descrito previamente, por ejemplo, en Abhayawardhane y Stewart, 1995, J. of Bacteriol. 177: 765-773 y Jones et al., Cell 104, 2001, 913-922.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para Mbl se exponen en la Tabla 4, y se marcan como SEC ID Nº: 3 y 4 respectivamente. Típicamente, un homólogo de mbl de otra bacteria es uno que tiene más de aproximadamente 50%, 55% o 65% de identidad, preferiblemente al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y particularmente preferiblemente al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% de identidad, con la secuencia de aminoácidos de 45 SEC ID Nº: 4. Tales variantes pueden incluir variantes alélicas. La identidad de variantes de SEC ID Nº: 4 puede medirse sobre una región de al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 330 o más aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 4 o más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de SEC ID Nº: 4.

La identidad de aminoácidos puede calcularse usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo usado en sus ajustes por defecto) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395) . Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o alinear secuencias (tal como identificar secuencias bivalentes o correspondientes (típicamente en sus ajustes por defecto) ) , por ejemplo como se describe en Altschul S. F.... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un inhibidor de LtaS que comprende:

(a) proporcionar bacterias gram positivas en las que las bacterias comprenden una mutación en el gen mbl u homólogo del mismo que altera la función del gen mbl u homólogo del mismo;

(b) cultivar las bacterias de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menor de 3 mM;

(c) supervisar el crecimiento de las bacterias;

en el que el crecimiento o crecimiento más rápido de las bacterias en comparación con crecimiento en ausencia de la sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mutación en el gen mbl comprende deleción de parte 15 de o todo el gen mbl.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se suprime el gen mbl completo.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las condiciones de magnesio bajo comprenden una

cantidad de magnesio tal que la bacteria crezca a menos del 10% de la velocidad de las bacterias que tienen la misma deleción de mbl cuando crecen en condiciones de Mg2+ 20 mM.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las condiciones de magnesio bajo comprenden Mg2+

menor de 1 mM. 25

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las bacterias se cultivan en medio no complementado con Mg2+ adicional.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende supervisar la densidad óptica del 30 cultivo para supervisar con respecto al crecimiento.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el método comprende cultivar una cepa de bacterias mutantes de mbl en presencia de Mg2+ alto, diluirla en medio de Mg2+ bajo y transferirla a un tubo de muestra, añadir una sustancia de ensayo y supervisar con respecto al crecimiento bacteriano supervisando la densidad óptica en el

pocillo de muestra.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las bacterias se cultivan en una placa de agar que contiene medio Mg2+ bajo, se aplica puntualmente sustancia de ensayo en la placa y se detecta crecimiento bacteriano mediante inspección visual de la placa.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se cultivan bacterias que comprenden el mutante de mbl en Mg2+ alto antes de dilución y proliferación en las placas de agar.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la bacteria gram positiva es un bacilo. 45

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el bacilo es B. subtilis.