Variante de una alfa-amilasa parental de tipo Termamyl, que presenta actividad de alfa-amilasa y que tiene unadependencia de iones de calcio disminuida con respecto a la alfa-amilasa parental,

que comprende una mutación en unaposición que corresponde a al menos una de las siguientes posiciones en la SEC ID No: 2:

N104, A349, 1479, L346, I430, N457, K385, F350, 1411, H408 o G303.

Método para diseñar mutantes de alfa-amilasa con propiedades predeterminadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos mutantes de a-amilasa con dependencia de Ca2+ disminuida, basándose en la estructura tridimensional hasta ahora desconocida de la a-amilasa bacteriana SEC ID No 2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las a-amilasas (a-1, 4 glucan-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas capaces de hidrolizar almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados. Casi todas las a-amilasas estudiadas tienen algunas regiones conservadas con aproximadamente la misma longitud y separación. Una de estas regiones se asemeja al

2+

sitio de unión de Ca de calmodulina y las otras se estiman necesarias para el centro activo y/o la unión del sustrato.

Aunque se conoce la secuencia de aminoácidos y de este modo la estructura primaria de un gran número de aamilasas, se ha comprobado que es muy difícil determinar la estructura tridimensional de todas las a-amilasas. La estructura tridimensional se puede determinar mediante análisis cristalográfico de rayos X de cristales de a-amilasa, pero ha resultado ser difícil obtener cristales de a-amilasa adecuados para resolver realmente la estructura.

Hasta ahora sólo se ha determinado la estructura tridimensional de algunas a-amilasas a alta resolución. Éstas incluyen la estructura de la TAKA a-amilasa de Aspergillus or y zae (Swift et al., 1991) , la amilasa ácida de Aspergillus niger (Brady et al, 1991) , la estructura de la a-amilasa pancreática porcina (Qian et al., 1993) , y la alfa-amilasa de cebada (Kadziola et al. 1994, Journal of Molecular Biology 239: 104-121, A. Kadziola, Thesis, Dept of Chemistr y , U. of Copenhagen, Denmark) . Además, se conoce la estructura tridimensional de una ciclodextrina glicosiltransferasa (CGTasa) de Bacillus circulans (Klein et al., 1992) (Lawson et al., 1994) . La CGTasa cataliza el mismo tipo de reacciones que las a-amilasas y muestra cierta similitud estructural con las a-amilasas.

Además, se han descrito la cristalización y los estudios de rayos X preliminares de las a-amilasas de B. subtilis (Chang et al. (1992) y Mizuno et al. (1993) ) . No se ha registrado ninguna estructura final de B. subtilis. Análogamente, se ha registrado la preparación de cristales de a-amilasa de B. licheniformis (Suzuki et al. (1990) , pero no hay informes posteriores disponibles sobre el análisis cristalográfico de rayos X o la estructura tridimensional.

Diferentes equipos de investigación han intentado construir estructuras tridimensionales basándose en las anteriores estructuras de a-amilasa conocidas. Por ejemplo, Vihinen et al. (J. Biochem. 107: 267-272, 1990) , revela el modelado (o simulación por ordenador) de una estructura tridimensional de la a-amilasa de Bacillus stearothermophilus basándose en la estructura de la TAKA amilasa. El modelo se usó para investigar consecuencias estructurales hipotéticas de diferentes mutaciones dirigidas de la a-amilasa de B. stearothermophilus. E.A. MacGregor (1987) predice la presencia de a-hélices y

º-barriles en a-amilasas de distintas fuentes, incluyendo la cebada, el páncreas de cerdo y el Bacillus amyloliquefaciens, prediciendo algoritmos con base en la estructura conocida de la TAKA a-amilasa de A. or y zae y de la estructura secundaria. Además, se predicen los bucles y subsitios posibles que se pueden encontrar presentes en, p. ej., la a-amilasa de B. amyloliquefaciens (con base en una comparación con la secuencia y la estructura de A. or y zae) .

A.E. MacGregor (Starch/Stärke 45 (1993) , No. 7, p. 232-237) presenta una revisión de la relación entre la estructura y la actividad de enzimas relacionadas con la a-amilasa.

Hasta ahora, no ha estado disponible ninguna estructura tridimensional para las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (las cuales se denominan en el contexto presente "a-amilasas de tipo Termamyl") , incluyendo la a-amilasa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B. stearothermophilus.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCIÓN

La estructura tridimensional de una a-amilasa bacteriana de tipo Termamyl se ha aclarado ahora. Con base en un análisis de dicha estructura es posible identificar partes estructurales o residuos de aminoácidos específicos que parezcan ser importantes a partir de consideraciones estructurales o funcionales para conferir las diferentes propiedades a las aamilasas de tipo Termamyl. Además, al comparar la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl con estructuras conocidas de las a-amilasas fúngicas y de mamíferos mencionadas arriba, se ha descubierto que existen algunas similitudes entre las estructuras, pero que también existen algunas diferencias estructurales sorprendentes e imprevistas previamente entre las a-amilasas. La presente invención se basa en estas conclusiones y se refiere sólo a las variantes de las reivindicaciones 1

7. Los siguientes "aspectos" se consideran como formas de realización generales y no definen el alcance de la invención o de las reivindicaciones.

Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para construir una variante de una aamilasa parental de tipo Termamyl, teniendo esta variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) analizar la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl con el propósito de identificar al menos un residuo de aminoácido

o al menos una parte estructural de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl, creyendo que el residuo de aminoácido

o la parte estructural es relevante para alterar dicha propiedad de la a-amilasa parental de tipo Termamyl (según se evaluó con base en consideraciones estructurales o funcionales) , ii) construir una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, que en comparación con la a-amilasa parental de tipo Termamyl, se ha modificado en el residuo de aminoácido o parte estructural identificada en i) de manera que altera dicha propiedad, y iii) analizar la variante de a-amilasa de tipo Termamyl resultante para dicha propiedad.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un método para construir una variante de una a-amilasa parental de tipo Termamyl, teniendo la variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) comparar la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo Termamyl con la estructura de una a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, ii) identificar una parte de la estructura de la a-amilasa de tipo Termamyl diferente de la estructura de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl, y iii) modificar la parte de la a-amilasa de tipo Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de a-amilasa de tipo Termamyl, una o más propiedades por las cuales difiere de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

En un tercer aspecto la invención se refiere a un método para construir una variante de una a-amilasa parental de tipo distinto de Termamyl, teniendo la variante actividad a-amilasa y dependencia de ión calcio disminuida en comparación con dicha a-amilasa parental, comprendiendo el método i) comparar la estructura tridimensional de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl con la estructura de una a-amilasa de tipo Termamyl, ii) identificar una parte de la estructura de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl diferente de la estructura de la aamilasa de tipo Termamyl, y iii) modificar la parte de la a-amilasa de tipo distinto de Termamyl identificada en ii) por la cual se obtiene una variante de aamilasa de tipo distinto de Termamyl, una o más propiedades por las cuales difieren de la a-amilasa parental de tipo Termamyl.

La propiedad que se puede alterar mediante los métodos anteriores de la presente invención puede ser, p. ej., la especificidad de sustrato,

En otros aspectos la invención se refiere a variantes de una a-amilasa de tipo Termamyl, a ADN que codifica este tipo de variantes y a métodos para preparar las variantes. Finalmente, la invención se refiere al uso de las variantes para diferentes objetivos industriales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La a-amilasa de tipo Termamyl

Es bien conocido... [Seguir leyendo]

1. Variante de una alfa-amilasa parental de tipo Termamyl, que presenta actividad de alfa-amilasa y que tiene una dependencia de iones de calcio disminuida con respecto a la alfa-amilasa parental, que comprende una mutación en una

posición que corresponde a al menos una de las siguientes posiciones en la SEC ID No: 2: N104, A349, 1479, L346, I430, N457, K385, F350, 1411, H408 o G303.

2. Variante segun la reivindicación 1, que comprende una mutación que corresponde a N104D; A349C+1479C;

L346C+1430C; N457D, E; N457D, E+K385R; F350D, E+1430R, K; F350D, E+1411R, K; H408Q, E, ND; y/o G303N, D, Q, E. 10

3. Construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Vector de expresión recombinante que porta una construcción de ADN según la reivindicación 3. 15

5. Célula que se transforma con una construcción de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4.

6. Uso de una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para el lavado y/o para lavavajillas,

desencolado o liquefacción de almidón. 20

7. Aditivo de detergente, composición de detergente, composición de detergente para lavavajillas a mano o automático, o composición para el lavado de ropa comprendiendo una variante de alfa-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1

2.