MÉTODO PARA AUMENTAR LA RESISTENCIA A LOS PATÓGENOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS MEDIANTE EXPRESIÓN DE UNA PEROXIDASA.

Método para aumentar la resistencia a los patógenos en plantas transgénicas mediante expresión de una peroxidasa La presente invención se refiere a un método para la producción de plantas transgénicas y/o células transgénicas con elevada resistencia a los patógenos fúngicos, el cual se caracteriza porque se introduce en la planta y allí se expresa una secuencia de ADN, la cual codifica para una proteína con la actividad de una peroxidasa. Así mismo la presente invención se refiere al empleo de ácidos nucleicos que codifican para una peroxidasa, para la producción de plantas transgénicas o bien células transgénicas con una elevada resistencia a los patógenos fúngicos. Además, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos, que codifican para una peroxidasa de cebada. Las enfermedades de las plantas que pueden ser causadas por diferentes patógenos como por ejemplo virus, bacterias y hongos, pueden conducir en los cultivos de plantas a considerables pérdidas en la cosecha, lo cual tiene por un lado consecuencias económicas, pero también amenazan la seguridad de la alimentación humana. Desde los últimos siglos, para el control de las enfermedades por hongos se han empleado fungicidas químicos. Mediante el empleo de estas sustancias pudo reducirse en verdad la magnitud de enfermedades vegetales, ciertamente hasta hoy no se descarta que estos compuestos ejercen un efecto dañino sobre el ser humano, animales y medio ambiente. De allí que para reducir en el largo plazo a un mínimo el consumo de agentes protectores convencionales para las plantas, es importante investigar el rechazo de diferentes plantas a los patógenos naturales respecto a diferentes agentes y aprovecharlos de modo específico para la producción de plantas resistentes a los patógenos, mediante manipulación tecnológica de genes, por ejemplo mediante la introducción de genes externos de resistencia o mediante la manipulación de la expresión endógena de genes en las plantas. Se define como resistencia a la capacidad de una planta para impedir o por lo menos para limitar el ataque y asentamiento por un agente del deterioro. En las resistencias que ocurren de modo natural, con las cuales las plantas se defiende contra la colonización por organismos fitopatógenos, pueden diferenciarse diversos mecanismos. Estas interacciones específicas entre patógenos y huésped determinan el transcurso de la infección (Schopfer y Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, editorial Springer, Berlin-Heidelberg). En relación con la resistencia específica a cepas, que también se denomina resistencia de huésped, se diferencia entre la interacción compatible y la incompatible. En la interacción compatible están para la interacción un patógeno virulento con una planta susceptible. El patógeno sobrevive y puede formar estructuras de multiplicación, por el contrario de huésped muere. En contraste, se habla de una interacción incompatible, cuando el patógeno infecta específicamente la planta, sin embargo inhibe en su crecimiento antes o después de ligeras manifestaciones de síntomas. En este caso la planta es resistente frente al respectivo agente (Schopfer y Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, editorial Springer, Heidelberg). Tanto en la interacción compatible como también la interacción incompatible tiene lugar una reacción de defensa del huésped frente al patógeno. Las bases genéticas para las interacciones compatible o bien incompatible huésped/patógeno fueron descritas mediante la hipótesis gen-por-gen (Flor (1971) Annu. Rev. Phytopathology 9: 275 296). El prerrequisito para el reconocimiento del patógeno específico para la raza es la interacción directa o indirecta del producto de genes de resistencia dominante o semi-dominante (gen R) de la planta con un producto, el cual desciende del gen avirulento complementario y dominante (gen Avr) del fitopatógeno (Keen (1992) Annu. Rev. Genet. 24: 447 - 463; Staskawicz et al. (1995) Science 268: 661 - 667). Por el contrario cuando el agente de la enfermedad pierde el gen avirulento complementario, puede desencadenarse la enfermedad. El modelo gen-por-gen se ha comprobado para muchas infecciones de orín, quemadura, verdaderas así como falsas por oídio, sin embargo no es aplicable para todas las interacciones parásito-huésped. Sin embargo, en la naturaleza esta resistencia específica a la cepa es vencida frecuentemente debido al rápido desarrollo evolutivo de los patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 Nr. 7: 626 - 633). Por el contrario la resistencia de no huésped confiere una protección fuerte, amplia y duradera contra los fitopatógenos. Se entiende por la resistencia de no huésped al fenómeno según el cual un patógeno en una determinada especie de planta puede causar una enfermedad, aunque no en otra especie de planta genéticamente similar (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259 - 264). Aunque éstas interesantes propiedades son las bases genéticas y biológico-moleculares para la resistencia de no huésped, hasta ahora son sólo poco entendidas. Existe tanto evidencia de que la resistencia de no huésped es inducida por sustancias no específicas como también de que proteínas individuales de patógenos en el tipo de la interacción gen-por-gen promueven la reacción de resistencia de no huésped (Heath (1981) Phytopathology 71: 1121 - 1123; Heath (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol. 58: 53 - 54; Kamoun et al. (1998) Plant Cell 10: 1413 - 1425; Lauge et al. (2000) Plant J. 23: 735 - 745; Whalen et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6743 - 6747). 2 E05768621 10-11-2011 Otra base por la cual sólo esporádicamente ocurre la colonización de plantas por fitopatógenos, es que debido a una carencia de sustancias y estructuras que son necesarias en el curso de la infección, el patógeno no puede formar estructuras de infección. Además, barreras de resistencia preformadas o inducidas de modo no específico, las cuales ya están presentes antes de la infección por un patógeno, pueden también impedir la formación de 5 estructuras de infección. Esta resistencia es definida como resistencia base o resistencia no específica de cepa y es mantenida mediante mecanismos de defensa pasivos y activos. Los diferentes mecanismos de resistencia que son responsables por la resistencia o sensibilidad de un tipo de planta o sus variedades cultivadas frente a determinados patógenos de plantas, deberían por ejemplo ser representados para el agente de oídio (Blumeria graminis), el cual invade varios cereales diferentes. El hongo de oídio pertenece a la especie de los Ascomycetes e infecta además de trigo y cebada también centeno, avena y numerosas hierbas. Las pérdidas de rendimiento causadas en cebada y trigo pueden ascender en casos individuales hasta 25%. Por regla general que ellas están entre 5 y 15%. Además el oídio crea un puerto de acceso para otros agentes de enfermedades (hongo de cáncer, marrón de espelta, ataque de hoja de, etc.). El síntoma más notorio de enfermedad de una infección por oídio son las "pústulas de oídio blanco, las cuales se presentan predominantemente sobre el lado superior de la hoja y la vaina de la hoja. El verdadero oídio, Blumeria graminis, es biotrofo obligado, es decir él puede alimentarse sólo de sustancias vivas y no puede ser cultivado sobre medios nutritivos. En lugar de eso, el hongo influye el metabolismo de huésped de modo que promueve su propio crecimiento (Ferrari et al. (2003) The Plant Journal 35: 193 - 205). El hongo de oídio invade exclusivamente la capa de células de la epidermis de hojas de cebada. El hongo penetra las células de la planta a través de la pared celular de modo mecánico y enzimático, por medio de un espigón de penetración que son conidias, es decir esporas formadas asexualmente. El ataque exitoso de hojas de cebada es logrado cuando se ha formado la haustoria, que es el órgano fúngico de manutención. Las haustorias privan de sus nutrientes a las células de las plantas, en lo que las células vecinas no infectadas compensan esta pérdida de nutrientes y se mantienen vivas mediante ello. Mediante el flujo de nutrientes en las células deterioradas se asegura el hongo una base de supervivencia por un cierto tiempo. El hongo de oídio como tipo abarca varias formas especiales dependiendo de si el respectivo hongo de oídio ataca por ejemplo trigo o cebada. En el caso del ataque de cebada se trata de Blumeria graminis f sp. hordei, mientras que en el ataque de trigo se trata de Blumeria graminis f sp. Tritici. Además, dentro de las diferentes formas especiales, pueden identificarse diversas cepas o patotipos, los cuales respecto a diferentes variedades cultivadas de clases de huésped exhiben una diferente resistencia. Las respectivas formae speciales atacan en cada caso sólo determinado tipo de planta, sin embargo no... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de plantas o bien células de plantas transgénicas con elevada resistencia a los patógenos fúngicos en comparación con plantas o bien células de plantas de tipo silvestre, caracterizado porque abarca las siguientes etapas: a) producción de una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye los siguientes elementos en orientación 5-3: - secuencias reguladoras de un promotor activo en células de plantas, - una secuencia de ADN enlazada a ellas de modo operativo, elegida de entre el grupo consistente en: i) secuencias de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que son codificados en SEQ ID No. 1, ii) secuencias de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2, y/o iii) secuencias de ADN que sobre la secuencia total de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID No. 1 exhiben una identidad de secuencia de por lo menos 80%, y en las cuales codifican para una proteína con la actividad de una peroxidasa b) transferencia de la molécula de ácido nucleico recombinante de a) a células vegetales y expresión de las secuencias de ADN, y c) regeneración de plantas de las células de plantas transformadas donde en la etapa b) ocurre la integración de la molécula de ácido nucleico recombinante de la etapa a) en el genoma vegetal. 2. Molécula aislada de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico elegida dentro del grupo consistente en: i) secuencias de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que son codificados de la SEQ ID No. 1, ii) secuencias de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican para una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2, y/o iii) secuencias de ADN que incluyen secuencias de nucleótidos que sobre la totalidad de la secuencia de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID No. 1 exhiben una identidad de secuencia de por lo menos 80%, y que codifican para una proteína con la actividad de una peroxidasa. 3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la secuencia de ácido nucleico proviene de Hordeum vulgare. 4. Proteína recombinante de peroxidasa codificada mediante una secuencia de ácido nucleico como se indica en la reivindicación 1. 5. Molécula recombinante de ácido nucleico que incluye los siguientes elementos en orientación 5-3: - secuencias reguladoras de un promotor activo en células vegetales, - secuencia de ADN enlazada de modo operativo a ella como se indica en la reivindicación 1. 6. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 5, que incluye además secuencias reguladoras que puede servir en las células vegetales como señales de transcripción, terminación y/o poliadenilación y las cuales están enlazadas de modo operativo a las secuencias de ADN según la reivindicación 1. 7. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia de ADN se expresa bajo control de un promotor constitutivo. E05768621 10-11-2011   8. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 7, caracterizada porque el promotor es el promotor 35S CaMV o el promotor ubiquitina. 9. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia ADN se expresa bajo el control de un promotor específico de tejido. 10. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 9, caracterizado porque el promotor específico de tejido es un promotor específico de epidermis, mesofilo u hoja. 11. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia ADN se expresa bajo el control de un promotor inducible. 12. Molécula recombinante de ácido nucleico según la reivindicación 11, caracterizada porque el promotor inducible es un promotor inducible por patógeno o herida. 13. Célula vegetal transgénica que contiene una secuencia de ácido nucleico como se describe en la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico está presente en una cinta de expresión realizada mediante métodos de tecnología genética, en la cual a) la secuencia de ácidos nucleicos o b) una secuencia de control genéticamente unida de modo funcional con las secuencias de ácidos nucleicos o c) a) y b) no se encuentran en su ambiente genético natural. 14. Células vegetales transgénicas según la reivindicación 13, que exhiben un elevado contenido de una proteína frente a las células de tipo silvestre según la reivindicación 4. 15. Células vegetales transgénicas según las reivindicaciones 13 o 14, que exhiben una elevada resistencia contra los patógenos fúngicos respecto a las células de tipo silvestre. 16. Células vegetales transgénicas según la reivindicación 15, que exhiben una elevada resistencia frente a los hongos oídio, del óxido y/o septoria. 17. Células vegetales transgénicas según la reivindicación 16, que exhiben una elevada resistencia frente a formae especiales de oídio. 18. Plantas transgénicas así como partes transgénicas de estas plantas, productos transgénicos de cosecha y material transgénico de multiplicación de estas plantas, como protoplastos, células vegetales, callo, semillas, bulbos, estacas, así como los descendientes transgénicos de estas plantas que contienen unas células vegetales según una de las reivindicaciones 13 a 17. 19. Plantas transgénicas según la reivindicación 18, caracterizadas porque la planta transgénica es una planta monocotiledónea. 20. Plantas transgénicas según la reivindicación 19, caracterizadas porque las plantas monocotiledóneas son plantas que pertenecen a los géneros Avena(Avena), Triticum (trigo), Secale (centeno), Hordeum (cebada), Oryza (arroz), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (mijo) o Zea (maíz). 21. Plantas transgénicas según la reivindicación 18, caracterizadas porque las plantas transgénicas son plantas dicotiledóneas. 22. Plantas transgénicas según la reivindicación 21, caracterizadas porque las plantas dicotiledóneas son algodón, leguminosas como frutas de vaina, alfalfa, granos de soya, colza, canola, tomate, remolacha azucarera, patata, plantas ornamentales, girasol, tabaco o árboles. 23. Empleo de una secuencia de ADN como se indica en la reivindicación 1 para la producción de plantas y células de plantas transgénicas con elevada resistencia a los patógenos fúngicos en comparación con plantas de tipo silvestre o bien células de plantas de tipo silvestre. 24. Empleo según una secuencia de ADN como se indica en la reivindicación 1 para la identificación de plantas que muestran una resistencia de no huésped frente a patógenos fúngicos. 25. Empleo de una secuencia de ADN como se indica en la reivindicación 1 como marcador para resistencia de no huésped en cereales. 41 E05768621 10-11-2011   42 E05768621 10-11-2011