Método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta del mevalonato en Escherichia coli,

comprendiendo el método:

(i) cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y en el que la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica genéticamente adicionalmente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre:

(a) una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b) una mevalonato quinasa;

(c) una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y

(ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.

Método para aumentar la producción de compuestos isoprenoides

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de la producción de compuestos isoprenoides, y en particular, a células huésped que son modificadas genéticamente para producir compuestos isoprenoides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente amplio y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintético común, es decir, un único precursor metabólico, isopentenil difosfato (IPP) . Se han descrito por lo menos 20.000 isoprenoide. Por definición, los isoprenoides están formados de las denominadas unidades de isopreno (C5) . El número de átomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40) , aunque se han descrito isoprenoides irregulares y politerpenos. Los compuestos isoprenoides también se refieren como "terpenos" o "terpenoides". Los miembros importantes de los isoprenoides incluyen carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen, por ejemplo, licopeno, 1-caroteno, y similares, muchos de los cuales actúan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, por ejemplo, artemisinina, un compuesto que tiene material contra la malaria. Los diterpenoides incluyen, por ejemplo, taxol, un agente quimioterapéutico contra el cáncer.

Los isoprenoides comprenden la familia más numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y otras fuentes naturales se utilizan como compuestos de aromas y fragancias comerciales, así como fármacos contra la malaria y el cáncer. Una mayoría de los compuestos terpenoides que se utilizan actualmente son productos naturales o sus derivados. Los organismos de origen (por ejemplo, árboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales no son susceptibles de un cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente viables ni de manipulación genética para una mayor producción o derivatización de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben producirse semisintéticamente a partir de análogos o sintéticamente utilizando síntesis química convencional. Además, muchos productos naturales presentan estructuras complejas y, como resultado, son actualmente caros o imposibles de sintetizar. Dichos productos naturales deben extraerse de sus fuentes nativas, tales como árboles, esponjas, corales y microbios marinos; o producirse sintéticamente o semisintéticamente a partir de precursores abundantes. La extracción de un producto natural a partir de una fuente nativa está limitada por la disponibilidad de la fuente nativa; y la producción sintética o semisintética de productos naturales puede sufrir un rendimiento bajo y/o un coste elevado. Dichos problemas de producción y disponibilidad limitada de la fuente natural pueden limitar el desarrollo comercial y clínico de dichos productos.

La biosíntesis de productos naturales de isoprenoides en microbios modificados podría aprovechar el potencial comercial y terapéutico sin explotar de estos recursos naturales y producir productos de química fina y farmacéuticos menos caros y más ampliamente disponibles. Un obstáculo en cuestión para la biosíntesis de terpenoides a nivel elevado es la producción de precursores de terpenos. Los estudios previos han demostrado que, cuando se expresa en E. coli, la ruta de mevalonato proporciona la producción de isopentenil pirofosfato (IPP) , que se puede isomerizar y polimerizar en isoprenoides y terpenos de valor comercial. La redirección óptima de metabolismo microbiano hacia la producción de isoprenoides requiere que la ruta biosintética introducida se modifique correctamente para canalizar eficientemente el carbono al IPP y no permitir la formación de intermedios que pueden ser tóxicos. De hecho, se ha observado que la expresión de enzimas que producen mevalonato puede inhibir el crecimiento celular y limitar la productividad de cultivos microbianos. Se sugirió que la inhibición del crecimiento descrita previamente tras la expresión de la ruta de mevalonato en ausencia de una IPP isomerasa, FPP sintasa, y terpeno sintasa conducía a la acumulación de niveles tóxicos de IPP.

Existe la necesidad en la técnica por células huésped mejoradas productoras de isoprenoides o precursores de isoprenoides que proporcionen un crecimiento robusto de células huésped y una producción a nivel elevado de compuestos isoprenoides, así como precursores de poliprenil difosfato de dichos compuestos. La presente invención se refiere a esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.

Literatura [0006] Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/005678; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21 (7) :796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol.

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DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de un mecanismo de mevalonato en Escherichia coli, comprendiendo el método:

(i) cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y donde la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas de la ruta del mevalonato heterólogas adicionales seleccionadas entre:

(a) una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b) una mevalonato quinasa;

(c) una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa;

en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativa de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativa de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxica para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y (ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.

La presente invención proporciona además una célula huésped modificada genéticamente que produce un isoprenoide o precursor de isoprenoide, en la que la célula huésped modificada genéticamente es una célula huésped procariota que no produce normalmente isopentenil pirofosfato a través de un mecanismo de mevalonato, en la que la célula huésped modificada genéticamente se modifica genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, en el que la célula huésped modificada se modifica adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas de la ruta del mevalonato heterólogas adicionales seleccionadas entre:

(a) una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b) una mevalonato quinasa;

(c) una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa;

en la que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativa de la HMGR producida en la célula huésped modificada genéticamente... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta del mevalonato en Escherichia coli, comprendiendo el método:

(i) cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y en el que la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica genéticamente adicionalmente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre:

(a) una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b) una mevalonato quinasa;

(c) una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y

(ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la acetoacetil-CoA tiolasa es heteróloga a la célula de E. coli modificada genéticamente.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGR.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGS.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha célula de E. coli modificada comprende un plásmido con un número de copias bajo que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica HMGS.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un ácido nucleico heterólogo que ha sustituido el gen de HMGS heterólogo, y en el que dicho ácido nucleico heterólogo tiene un nivel de actividad inferior al del gen de HMGS endógeno.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un constructo de expresión que comprende una versión modificada de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 1 en que el sitio de unión a ribosoma en dirección 5' con respecto a HMGS ha sido alterado, de manera que se reduce la traducción en comparación con una E. coli en que la SEQ ID NO: 1 no está alterada.

8. Método según la reivindicación 1, en el que la E. coli modificada comprende vectores que codifican HMGR y HMGS, en el que las regiones codificantes de HMGR y HMGS están bajo el control de diferentes promotores.

9. Célula huésped modificada genéticamente que produce un isoprenoide o precursor de isoprenoide, en la que la célula huésped modificada genéticamente es una célula huésped procariota que no produce normalmente isopentenil pirofosfato a través de la ruta del mevalonato, en la que la célula huésped modificada genéticamente está modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, en la que la célula huésped modificada genéticamente está modificada adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre:

(a) una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b) una mevalonato quinasa;

(c) una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en la que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en la que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula huésped modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula huésped modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular

10. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la célula huésped es una cepa de Escherichia coli.

11. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la acetoacetil-CoA tiolasa es heteróloga a la célula huésped modificada genéticamente.

12. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la célula huésped modificada genéticamente comprende una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGR.

13. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende un plásmido con un número bajo de copias que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica HMGS.

14. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende un ácido nucleico heterólogo que ha sustituido el gen de HMGS heterólogo, y en la que dicho ácido nucleico heterólogo tiene un nivel de actividad inferior al del gen de HMGS endógeno 15. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende un constructo de expresión que comprende una versión modificada de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 1 en que el sitio de unión a ribosoma en dirección 5' con respecto a HMGS ha sido alterado, de manera que se reduce la traducción en comparación con una E. coli en que la SEQ ID NO: 1 no está alterada.

16. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende vectores que codifican HMGR y HMGS, en la que las regiones codificantes de HMGR y HMGS están bajo el control de diferentes promotores.

FIG.10