METODO DE CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS FANERÓGAMAS MARINAS.

Método de cultivo in vitro de plantas fanerógamas marinas.

La presente invención se refiere a un método adecuado para cultivar plantas fanerógamas marinas y,

más en concreto la especie Posidonia oceánica que controla la inducción, mantenimiento y maduración de cultivos celulares hasta alcanzar estadios pre-embrionarios. El método incluye extraer explantos seleccionados de la zona distal del ápice meristemático foliar de una plántula de fanerógama marina de la especie Posidonia oceánica, cultivar los explantos obtenidos en un medio de cultivo líquido, obtener células libres mediante el empleo de técnicas de digestión celular, establecer cultivos celulares induciendo la formación de masas pre-embriogenética (PEM), recoger las masas pre-embriogenéticas (PEMs) obtenidas y ponerlas en contacto con un medio de cultivo sólido permitiendo la maduración de las PEMs. Este método permite obtener material vegetal clonado con el que llevar a cabo repoblaciones de fondos marinos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201000586.

Solicitante: EMPRESA DE TRANSFORMACION AGRARIA, S.A. (TRAGSA).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCIA JIMENEZ,PILAR, ROBAINA ROMERO,RAFAEL, PEREZ NAVARRO,Eva A.

Fecha de Publicación: 16 de Octubre de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes:

A01H4/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos.

METODO DE CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS FANERÓGAMAS MARINAS.

Fragmento de la descripción:

Método de cultivo in vitro de plantas fanerógamas marinas.

La presente invención se refiere a un método para cultivar plantas fanerógamas marinas y, más en concreto, la especie Posidonia oceánica que controla la inducción, mantenimiento y maduración de cultivos celulares hasta alcanzar estadios pre-embrionarios, haciendo posible, por ejemplo, la micropropagación (organogénesis o embriogénesis somática) de plantas fanerógamas marinas y, más en concreto la especie Posidonia oceánica.

En la actualidad la actividad humana sobre el litoral constituye una importante amenaza a la supervivencia de plantas marinas del tipo fanerógamas derivando en una regresión de estos ecosistemas y un consecuente detrimento de la calidad de sus aguas, y como consecuencia esto deriva en un grave problema medioambiental. La restauración de estos ecosistemas requiere de métodos que permitan la repoblación de estas zonas dañadas de una manera rápida, abundante y sin dañar praderas naturales.

Ante tales perspectivas el cultivo in vitro supone una alternativa válida a las técnicas de repoblación mediante técnicas de propagación vegetativa de explantos, como fragmentos de rizoma, o al cultivo en condiciones asépticas de plántulas germinadas in vitro.

Sin embargo las plantas fanerógamas marinas se nos presentan como especies aparentemente recalcitrantes a la aplicación de las técnicas de propagación in vitro. La especie Posidonia oceánica presenta el problema añadido de ser, de entre las especies fanerógamas marinas, la que menor tasa de propagación por semillas presenta, ya que no florece todos los años, y la semilla no tiene dormancia, por lo que no existen bancos naturales de semillas. Este inconveniente dificulta la obtención de fuente de material de explanto a partir del tejido embrionario de la semilla.

La presente invención proporciona un método que controla la inducción, mantenimiento y maduración de cultivos celulares a partir de explantos seleccionados de la zona distal del ápice meristemático foliar de plántulas de la especie Posidonia oceánica permitiendo obtener material vegetal clonado con el que llevar a cabo repoblaciones de fondos marinos.

Antecedentes de la invención

En la actualidad no se conocen estudios de micropropagación (organogénesis o embriogénesis somática) que hayan tenido éxito con plantas fanerógamas marinas. Los estudios realizados con estas plantas marinas no han tenido como objetivo la inducción de respuestas morfogenéticas in vitro, y se limitan a la propagación vegetativa de explantos, como fragmentos de rizoma, o al cultivo en condiciones asépticas de plántulas germinadas in vitro.

En el documento Loqués, F., Caye, G., Meinesz, A., 1990. Axenic cultura of selected tissue of Posidonia oceanica. Aquatic Botany 37(2), 171-188, se describe un método de cultivo in vitro mediante el cual se obtuvieron hojas de la especie Posidonia oceánica, pero no se obtuvieron ni cultivo celular ni plántula.

En los documentos Balestri E., Piazzi L., Cinelli F., 1998. In vitro germination and seedling development of Posidonia oceánica. Aquatic Botany 60, 83-93, y Balestri, E., Bertini, S., 2003. Growth and development of Posidonia oceanica seedling treated with plant growth regulators: possible implications for meadow restoration. Aquatic Botany 76, 291-297, se describen métodos de cultivo de plántulas in vitro procedentes de semillas germinadas en laboratorio.

En los documentos Meinesz, A., Caye, G., Loqués, F., Molenaar, H., 1991. Growth and development in culture of orthotropic rhizomes of Posidonia oceanica. Aquatic Botany 39(3-4), 367-377, se describen métodos de cultivo in vitro a partir de segmentos de rizoma terminal.

La patente ES 2.161.313 describe un método de cultivo de plantas fanerógamas mediante el control de la calidad de la luz amarilla en el período de luz de día después de una etapa de cultivo de plántulas, en particular, después del desarrollo de hojas verdaderas hasta la floración o la formación de brácteas para así controlar las formas que conciernen la altura de una planta, la longitud de una rama, la longitud de la corola, la longitud del tubo de la flor, el numero de flósculos, las dimensiones del grupo de flores, el numero de brácteas o la longitud de una bráctea.

Por otro lado las patentes ES 2.069.504, FR-A-2.623.366 y FR-A-2.239.120 describen técnicas de repoblación de fondos marinos mediante esquejes de Posidonia oceánica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método adecuado para cultivar plantas fanerógamas marinas y, más en concreto, la especie Posidonia oceánica que controla la inducción, mantenimiento y maduración de cultivos celulares hasta alcanzar estadios pre-embrionarios que consiste esencialmente en las siguientes etapas:

i)Extraer explantos seleccionados de la zona distal del ápice meristemático foliar de una plántula de fanerógama marina de la especie Posidonia oceánica. ii)Cultivar los explantos obtenidos en la etapa i) en un medio de cultivo líquido que comprende una cantidad efectiva de un antioxidante o mezcla de antioxidantes que evitan la formación de fenoles. iii)Obtener células libres a partir de los explantos cultivados en etapa ii) mediante el empleo de técnicas de digestión celular. iv)Establecer cultivos celulares a partir de las células obtenidas en la etapa iii) en contacto con un medio de cultivo líquido, que comprende una cantidad efectiva de una fuente de energía de carbohidratos, induciendo la formación de masa pre-embriogenética (PEM). v)Recoger las masas pre-embriogenéticas (PEMs) obtenidas en iv) y ponerlas en contacto con un medio de cultivo sólido que comprende una cantidad efectiva de una fuente de regulador del potencial celular redox, permitiendo la maduración de las PEMs. vi)Transferir las masas pre-embriogenéticas (PEMs), de la etapa iv o v, a placas u otro tipo de sistema de cultivo, en insertos provistos de membrana y depositar estos en placas u otro tipo de sistema de cultivo en los que la membrana quede en contacto con el medio de cultivo.

De acuerdo con la invención, se emplea como explante material vegetal seleccionado a partir del meristemo en la base de las escamas en el brote de hojas del rizoma plagiotrópico.

Es característica así mismo de la invención el que en la etapa ii) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de ácido ascórbico mayor que 30 g/l, preferiblemente 150 g/l, una concentración de ácido cítrico mayor que 30 g/l, preferiblemente 150 g/l, y una concentración de tetraamina espermina menor que 10^-4 M, preferiblemente 10^-6 M.

Es así mismo objeto de la invención el que en la etapa iv) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de sacarosa mayor que 30 g/l, preferiblemente 130 g/l.

Conforme a la invención en la etapa v) se emplea, como fuente de regulador de potencial celular redox, glutatión en una concentración de entre 1 μM y 10 μM aproximadamente, y el glutatión se añade a la mezcla en estado oxidado y reducido.

También es característica de la invención el que la membrana, en la etapa vi, es una membrana de poliethylene terephthalate.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la selección de explantos a partir del meristemo en la base de las escamas en el brote de hojas de rizoma plagiotrópico en una plántula de fanerógama marina de la especie Posidonia oceánica.

Descripción detallada de una realización preferida de la invención

Aunque la invención se describe en términos de una realización específica preferida, será fácilmente evidente para los expertos en esta técnica que se pueden hacer diversas modificaciones, redisposiciones y reemplazos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas a la misma.

Reivindicaciones:

1. Un método adecuado para cultivar plantas fanerógamas marinas y, más en concreto, la especie Posidonia oceánica que controla la inducción, mantenimiento y maduración de cultivos celulares hasta alcanzar estadios pre-embrionarios que consiste esencialmente en las siguientes etapas:

i)Extraer explantos seleccionados de la zona distal del ápice meristemático foliar de una plántula de fanerógama marina de la especie Posidonia oceánica. ii)Cultivar los explantos obtenidos en la etapa i) en un medio de cultivo líquido que comprende una cantidad efectiva de un antioxidante o mezcla de antioxidantes que evitan la formación de fenoles. iii)Obtener células libres a partir de los explantos cultivados en etapa ii) mediante el empleo de técnicas de digestión celular. iv)Establecer cultivos celulares a partir de las células obtenidas en la etapa iii) en contacto con un medio de cultivo líquido, que comprende una cantidad efectiva de una fuente de energía de carbohidratos, induciendo la formación de masa pre embriogenética (PEM). v)Recoger las masas pre-embriogenéticas (PEMs) obtenidas en iv) y ponerlas en contacto con un medio de cultivo sólido que comprende una cantidad efectiva de una fuente de regulador del potencial celular redox, permitiendo la maduración de las PEMs. vi)Transferir las masas pre-embriogenéticas (PEMs), de la etapa iv o v, a placas u otro tipo de sistema de cultivo, en insertos provistos de membrana y depositar estos en placas u otro tipo de sistema de cultivo en los que la membrana quede en contacto con el medio de cultivo.

2. Un método según reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa ii) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de ácido ascórbico mayor que 30 g/l, preferiblemente 150 g/l.

3. Un método según reivindicación 1 y 2, caracterizado porque en la etapa ii) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de ácido cítrico mayor que 30 g/l, preferiblemente 150 g/l.

4. Un método según reivindicación 1, 2 y 3, caracterizado porque en la etapa ii) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de tetraamina espermina menor que 10^-4 M, preferiblemente 10^-6 M.

5. Un método según reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa iv) el medio de cultivo líquido contiene una concentración de sacarosa mayor que 30 g/l, preferiblemente 130 g/l.

6. Un método según reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa v) se emplea, como fuente de regulador de potencial celular redox, glutatión en una concentración de entre 1 μM y 10 μM aproximadamente.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6, caracterizado porque en la etapa v) el glutatión se añade a la mezcla en estado oxidado y reducido.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en la etapa i) se emplea como explante material vegetal seleccionado a partir del meristemo en la base de las escamas en el brote de hojas del rizoma plagiotrópico (1).

9. Un método según reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa vi) la membrana es una membrana de poliethylene terephthalate.

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