Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos.

La presente invención se refiere a medios de cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de algunas de las fracciones del fraccionamiento del plasma humano según el método de Cohn, más en particular, el sobrenadante de las fracciones I y II+III. Cuando dicho sobrenadante es adicionado como suplemento de medios de cultivo proporciona diferentes nutrientes y factores para un adecuado mantenimiento y/o proliferación de las células de mamíferos cultivadas. Además, la presente invención se refiere al procedimiento de preparación y al uso de dicho medio en el cultivo de células de mamíferos.

Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un suplemento para su uso en medios de cultivo de células de mamíferos. Dicho suplemento se obtiene a partir del plasma desfibrinado (sustancialmente libre de fibrinógeno y fibrina) de origen humano y, cuando es adicionado como suplemento de medios de cultivo proporciona los diferentes nutrientes y factores para un adecuado mantenimiento y/o proliferación de células cultivadas.

Antecedentes

Los cultivos celulares se utilizan en la industria biotecnológica principalmente para la producción de proteínas recombinantes y anticuerpos raonoclonales. Recientemente también se ha desarrollado una tecnología para el cultivo de diferentes tipos de células troncales para su utilización en la terapia celular, en combinación o no con la terapia génica.

Para poder cultivar y mantener con éxito las diferentes líneas celulares se necesita un medio que imite las condiciones del medio interno donde se encontrarían estas células in vivo. Generalmente, el medio de cultivo consta de un medio basal que garantiza el pH, los nutrientes y las sales y se pueden añadir una serie de suplementos que permiten la proliferación celular. Uno de los suplementos más utilizados es el suero sanguíneo de origen animal. El origen animal de este suero puede implicar serias restricciones para su utilización en la obtención de productos para uso en humanos, ya que al reconocer los residuos de origen animal como antígenos extraños se pueden originar reacciones adversas en los receptores. Además, los sueros animales poseen el inconveniente de que su composición no es definida, pues existe una gran variabilidad entre fabricantes por el uso de diferentes razas animales. También, debido al procedimiento de obtención, existe una gran variabilidad lote a lote, lo que implica que puedan ocurrir grandes variaciones en la capacidad de crecimiento y en la producción de un cultivo determinado.

La principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar el medio natural, como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios, tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, H. (1955). "The specific aminoacid requirements of mammalian cells (strain L) in tissue culture". J. Biol. Chem. 214 : 839.) y el más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan, J.G., Morton, J.H. y Parker, R.C. (1950). "Nutrition of animal cells in tissue culture. I Initial studies on a synthetic médium". Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 : 1.) eran medios definidos pero que precisan de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%.

A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 (Evans, V.J., Bryant, J.C., Fioramonti, M.C., McQuilkin, W.T., Sanford, K.K., y Earle, W.R. (1956), "Studies of nutrient media for tissue C cells in vitro. I A protein-free chemically defined médium for cultivation of strain L cells". Cancer REs. 16 : 77.), 135 (Evans, V.J. y Briant, J.C. (1965). "Advances in tissue culture at the National Cancer Institute in the United States of America". En "Tissue culture", edit. por C.V. Ramakrishnan (ed.). W. Junk. The Hague. pp. 145-167.), Ham F10 y F12 (Ham, R.G. (1963). "An improved nutrient solution for diploid Chínese hámster and human cell lines". Exp. Cell REs. 29 : 515., Ham, R.G. (1965). "Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined synthetic médium". Proc. Natl. Sci. USA 53 : 288.), serie de los MCDB (Ham, R.G. y McKeehan, W.L. (1978). "Development of improved media ans culture conditions for clonal growth of normal diploid cells". In vitro 14 : 11-22.) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes, D. y Sato, G. (1980). "Methods for growth of cultured cells in serum free-medium". Anal. Biochem. 102 : 255-270).

La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir.

Después de años de investigación en la composición de los medios, la elección de éstos sigue siendo empírica.

Los principales medios empleados y sus aplicaciones son:

- Medio Basal de Eagle (BME): es un medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10%. Se utiliza para el crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa.

- Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM): es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%).

- R.P.M.I. 1640: es un medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados.

- Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM): contiene cuatro veces, la concentración de aminoácidos y vitaminas que el BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) o HT (hipoxantina-timidina).

- Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM): es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, entre otros elementos. Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.

- McCoy 5ª: es un medio diseñado para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como humanas.

- Medio L-15 de Leibovitz: es un medio utilizado para el cultivo de virus.

- Medio F-10 de Ham: es un medio utilizado para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas.

- Medio F-12 de Ham: es un medio útil para el crecimiento de líneas celulares con suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.

- Medio 199: es un medio muy utilizado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías.

Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos:

1. Soluciones salinas equilibradas (BSS).

2. Aminoácidos.

3. Vitaminas.

4. Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular (nucleósidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lípidos).

5. Hormonas y factores de crecimiento (suero).

6. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos).

En los medios no definidos, las hormonas y factores de crecimiento suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El más utilizado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas.

La utilización de suero es problemática pues a pesar de que la composición del suero es conocida en parte, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables que pueden influir notablemente en el cultivo. Además, el suero varía de lote a lote, debido a la variabilidad de la propia técnica de obtención de la sangre, del proceso de obtención del suero (coagulación de la sangre) y de las condiciones de separación del suero, así como la diferencia entre las distintas fuentes de suero. Además, cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. Por otra parte, si se deben purificar productos del medio de cultivo, la presencia de componentes variables en el suero dificulta notablemente estos procesos.

Algunos factores séricos, como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF), estimulan la proliferación de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados, especialmente si se produce una gran variación en su contenido.

En conjunto, la inclusión de suero en los medios... [Seguir leyendo]

1. Medio para el cultivo de células de mamíferos caracterizado porque comprende, además de los nutrientes habituales de los medios de cultivos basales para cultivo de células de mamíferos, el sobrenadante de la fracción I del método de Cohn o el sobrenadante de la fracción II+III del método de Cohn.

2. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado porque los sobrenadantes de las fracciones de Cohn son obtenidos a partir de mezclas ("pooles") de, como mínimo, 1000 donantes humanos.

3. Medio de cultivo, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el sobrenadante de la fracción de Cohn se encuentra en forma desecada.

4. Medio de cultivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sobrenadante de la fracción de Cohn se encuentra en forma congelada.

5. Procedimiento de preparación de un medio de cultivo de células de mamíferos, según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la preparación del sobrenadante de la fracción I o la fracción II+III del fraccionamiento del plasma humano según el método de Cohn comprende las etapas de

- precipitación con etanol

- separación del sobrenadante

- congelación o desecación

y opcionalmente las etapas de

- dilución y/o

- diálisis o diafiltración y/o

- eliminación de agentes patógenos;

y la posterior adición del sobrenadante preparado de esta manera al medio de cultivo basal.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque el sobrenadante desecado se reconstituye en el medio de cultivo basal, en agua destilada o desionizada y apirógena, o en soluciones salinas o tampones habituales de cultivo celular.

7. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque el sobrenadante desecado se reconstituye en el medio de cultivo basal.

8. Procedimiento, según las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el plasma humano es obtenido a partir de mezclas ("pooles") de, como mínimo, 1000 donantes humanos.

9. Uso del medio de cultivo que comprende el sobrenadante de la fracción I del método de Cohn o el sobrenadante de la fracción II+III del método de Cohn para cultivar células de mamíferos.