Matriz que comprende un esqueleto proteico de origen natural reticulado.

Un armazón que comprende una pluralidad de unidades, cada una compuesta de un polímero sintético unido auna proteína de origen natural o una parte de la misma,

en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.

Matriz que comprende un esqueleto proteico de origen natural reticulado

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una matriz compuesta de un esqueleto proteico de origen natural reticulado por polietilenglicol (PEG) y, más particularmente, a procedimientos para generarla y usarla en la regeneración de tejidos.

La ingeniería tisular, es decir, la generación in vitro de nuevos tejidos vivos, se usa ampliamente para sustituir tejidos enfermos, traumatizados y otros tejidos enfermizos. La estrategia clásica de la ingeniería tisular utiliza células vivas y un armazón básico para el cultivo celular (Langer y Vacanti, 1993; Nerem y Seliktar, 2001) . Por tanto, la estructura de armazón intenta imitar la estructura natural del tejido que se está sustituyendo y proporcionar un soporte funcional temporal para las células (Griffith LG, 2002) .

Los armazones para ingeniería tisular se fabrican a partir de materiales biológicos o a partir de polímeros sintéticos. Los polímeros sintéticos tales como polietilenglicol (PEG) , hidroxiapatita/policaprolactona (HA/PLC) , ácido poliglicólico (PGA) , ácido poli-L-láctico (PLLA) , polimetil metacrilato (PMMA) , polihidroxialcanoato (PHA) , poli-4hidroxibutirato (P4HB) , polipropilenfumarato (PPF) polietilenglicol-dimetacrilato (PEG-DMA) , fosfato beta-tricálcico (beta-TCP) y politetrafluoroetileno (PTFE) no biodegradable proporcionan un control preciso sobre las propiedades mecánicas del material (Drur y y Mooney, 2003) .

Los procedimientos comunes de fabricación de armazones están basados en espumas de polímeros sintéticos. Sin embargo, la migración celular en el interior de los armazones sintéticos está limitada por la ausencia de oxígeno y de aporte de nutrientes. Para superar tales limitaciones, se han desarrollado nuevas estrategias que utilizan fabricaciones sólidas de forma libre y arquitectura vascular interna (Revisado en Sachlos E y Czernuszka JT, 2003; Eur. Cell Mater. 5: 29-39) . De igual modo, también se emplean procedimientos de liofilización para crear estructuras tridimensionales únicas con distinta porosidad y permeabilidad. Sin embargo, la creación de poros en estos materiales es un procedimiento agresivo que implica el uso de reactivos tóxicos que eliminan la posibilidad de moldear previamente construcciones tisulares con células vivas. Por lo tanto, muchos de los materiales prefabricados están sometidos a siembra de células poco uniforme y a poblaciones de células no homogéneas dentro de las construcciones. Además, generalmente los materiales se degradan desigualmente durante el proceso de cultivo tisular, creando un tejido altamente anisotrópico con cinética de crecimiento modificada.

La Patente de Estados Unidos Nº: 5.863.984 desvela matrices porosas formadas a partir de un biopolímero tal como colágeno, que está conjugado con PEG por medios químicos o por irradiación. La conjugación con PEG reduce la biodegradabilidad de la matriz, conservando de esta manera su estructura porosa.

Los armazones constituidos por PEG son altamente biocompatibles (Merrill y Salzman, 1983) y presentan características físicas versátiles en base a su porcentaje en peso, longitud de la cadena molecular y densidad de reticulación (Temenoff JS y col., 2002) . Además, los hidrogeles de PEG pueden realizar una transición controlada de líquido a sólido (gelificación) en presencia de suspensión celular (Elbert y Hubbell, 2001) . Además, la reacción de gelificación del PEG (es decir, PEGilación) puede realizarse en condiciones no tóxicas en presencia de un fotoiniciador (Elisseeff J y col., 2000; Nguyen y West, 2002) o mezclando una solución reactiva de dos partes del PEG funcionalizado y reticulando los constituyentes (Lutolf y Hubbell, 2003) .

Sin embargo, aunque los polímeros sintéticos mencionados anteriormente permiten un control preciso sobre el material armazón, a menudo ofrecen información biológica inadecuada para el cultivo celular. Como resultado, estos materiales no son adecuados para el cultivo tisular a largo plazo o para la regeneración tisular in vivo.

Por otro lado, los armazones de origen natural tales como colágeno, fibrina, alginato, ácido hialurónico, gelatina y celulosa bacteriana (CB) proporcionan señales biofuncionales y presentan diversas interacciones celular. Por ejemplo, la fibrina, un sustrato natural de remodelación tisular (Herrick S., y col., 1999) , contiene diversos dominios de señalización celular tales como sustrato de degradación por proteasas (Werb Z, 1999) y dominios de adhesión celular (Herrick S., 1999) . Sin embargo, como tales materiales biológicos presentan señales intrínsecas múltiples (por ejemplo, regulación de adhesión celular, proliferación, fenotipo celular, producción de matriz y actividad enzimática) , su uso como armazones en la regeneración tisular a menudo produce una regulación anómala de sucesos celulares (Hubbell, 2003) . Adicionalmente, los armazones naturales a menudo son mucho más débiles después de la reconstitución en comparación con la resistencia del material biológico original y pueden ejercerse escaso control para mejorar sus propiedades físicas.

Por lo tanto, el armazón ideal para la ingeniería tisular debe presentar las características estructurales de los materiales sintéticos con la biofuncionalidad de los materiales naturales (Leach JB, y col., 2004; Leach y Schmidt, 2005) . Para este fin, se han propuesto diversos procedimientos de preparación de armazones con biofuncionalidad natural y propiedades físicas de los polímeros sintéticos. Sin embargo, la mayoría de estas estrategias “híbridas”, no llegan a producir un biomaterial con amplia biofuncionalidad intrínseca y un amplio intervalo de propiedades físicas; principalmente debido a que solo emplean un único elemento biofuncional en el diseño del material. Por ejemplo, estudios previos describen la preparación de armazones que consisten en elementos biodegradables injertados en

el esqueleto de una red de hidrogel sintética. Los hidrogeles se prepararon a partir de PEG sintético que se reticuló con oligopéptidos cortos que contenían sustratos enzimáticos capaces de degradarse proteolíticamente mediante enzimas secretadas por células [Lutolf y col (2003) ; Gobin y West (2002) ]. Adicionalmente, para aumentar la biofuncionalidad de dichos hidrogeles, se injertaron motivos de adhesión sintéticos tales como las secuencias RGD [Lutolf y col (2003) ] o VEGF (Seliktar y col; 2004, Zisch AH, y col, 2003; FASEB J. 17: 2260-2. Publicado el 16 de octubre de 2003) en el esqueleto de PEG. Sin embargo, el uso de dichos armazones (en los que el PEG es el componente principal) estaba limitado por la bio-retroalimentación y/o respuestas celulares a largo plazo insuficientes que son esenciales para la estabilidad fenotípica.

Otros intentos para aumentar la biofuncionalidad de los armazones incluyen la fabricación de precursores de 100 aminoácidos, de tipo proteico, diseñados por ingeniería genética, que contienen, entre otras cosas, varios sustratos para proteasas y sitios de adhesión (Halstenberg y col. 2002; Biomacromolecules, 3: 710-23) . Sin embargo, el tamaño aumentado de los precursores proteicos y la presencia de grupos tiol, necesarios para la reacción de PEGilación, complica la purificación y la solubilización de los precursores durante el proceso de fabricación del armazón. Además, similar a los materiales biosintéticos basados en PEG, los armazones de precursores proteicos diseñados por ingeniería genética no proporcionan la suficiente biofuncionalidad para permitir una estabilidad a largo plazo.

Reduciendo la presente invención a la realización práctica, los autores de la presente invención han revelado que los armazones híbridos biosintéticos, compuestos de un esqueleto de fibrinógeno que está reticulado con cadenas laterales de polietilenglicol (PEG) funcional, son armazones excelentes, biodegradables y que tales armazones pueden usarse en aplicaciones de regeneración tisular.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un armazón que comprende una pluralidad de unidades, compuesta cada una por PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un hidrogel formado a partir del armazón de la reivindicación 1.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un procedimiento de generación... [Seguir leyendo]

1. Un armazón que comprende una pluralidad de unidades, cada una compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o una parte de la misma, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.

2. Un procedimiento de generación un armazón que comprende:

(a) la unión por covalencia de un polímero sintético a una proteína de origen natural o a una parte de la misma para obtener de esta manera una molécula precursora de polímero-proteína, y

(b) la reticulación de una pluralidad de dichas moléculas precursoras para generar de esta manera el armazón biodegradable, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado.

3. El armazón de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una molécula que puede reticularse, uniendo por covalencia dicha molécula dichas unidades.

4. El armazón o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.

5. El armazón o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-acrilato en estrella de 8 brazos.

6. El armazón o el procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA d.

2. kDa.

7. El armazón o el procedimiento de la reivindicación 6, en el que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho fibrinógeno en dichas unidades es de 2-400 a 1, respectivamente.

8. Un hidrogel formado a partir del armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7 o formado a partir del armazón producido por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 a 7.

9. El hidrogel de la reivindicación 8, en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno completo y en el que una concentración de dichas unidades en dicho hidrogel se selecciona de un intervalo de 0, 5-35%.

10. El hidrogel de la reivindicación 8, en el que dicho fibrinógeno es fibrinógeno fragmentado y en el que una concentración de dichas unidades en dicho hidrogel se selecciona de un intervalo de 0, 5-35%.

11. El hidrogel de la reivindicación 9, en el que el módulo de elasticidad de dicho hidrogel está en un intervalo de 0, 02-0, 11 kPa para un 10-20% de polímero.

12. El hidrogel de la reivindicación 10, en el que el módulo de elasticidad de dicho hidrogel está en un intervalo de 0, 01-0, 07 kPa para un 10-20% de polímero.

13. Una composición compuesta de un polímero sintético unido a una proteína de origen natural o a una parte de la misma, en el que dicho polímero sintético es PEG y en el que dicha proteína de origen natural es fibrinógeno desnaturalizado para su uso en

(a) la inducción de la formación in vivo de un tejido, en el que, dicha composición puede formar un armazón en un sujeto, induciendo así la formación de tejido in vivo, o

(b) el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular, en el que dicha composición puede formar un armazón en el sujeto, induciendo así la formación de un tejido y tratando el trastorno caracterizado por una lesión o pérdida tisular.

14. La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que adicionalmente al sujeto se le debe administrar una molécula que puede reticular dicha composición.

15. La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-acrilato (PEG-Ac) y PEG-vinilsulfona (PEG-VS) .

16. La composición de la reivindicación 15 para uso, en la que dicho PEG-Ac se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato en estrella de 4 brazos y PEG multi-acrilato en estrella de 8 brazos.

17. La composición de la reivindicación 16 para su uso, en la que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA d.

2. kDa.

18. La composición de la reivindicación 17 para su uso, en la que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho fibrinógeno en dicha composición es de 2-400 a 1, respectivamente.

19. La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.

20. La composición de la reivindicación 14 para su uso, en la que dicha molécula capaz de reticulación se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multi-acrilato y PEG-VS.

21. La composición de la reivindicación 13 para su uso, en la que dicho armazón es biodegradable.

22. La composición de la reivindicación 13 (b) para su uso, en la que dicha lesión tisular está asociada a un trastorno seleccionado del grupo que consiste en cirrosis hepática, diabetes de Tipo 1, fibrosis quística, cáncer de hueso, reparación de quemaduras y de heridas, degeneración macular relacionada con la edad, infarto de miocardio, reparación de miocardio, lesiones del SNC, defecto de cartílago reticular, degeneración de la vejiga y degeneración

intestinal.

23. Una composición de material que comprende polietilenglicol (PEG) unido a fibrinógeno desnaturalizado, en el que dicha composición de material puede formar un armazón.

24. La composición de material de la reivindicación 23, en la que dicho PEG se selecciona del grupo que consiste en PEG-acrilato (PEG-Ac) y PEG-vinilsulfona (PEG- VS) .

25. La composición de material de la reivindicación 24, en la que dicho PEG-Ac se selecciona del grupo que consiste en PEG-DA, PEG multiacrilato en estrella de 4 brazos y PEG multiacrilato en estrella de 8 brazos.

26. La composición de material de la reivindicación 25, en la que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4-kDa, PEG-DA de 6-kDa, PEG-DA de 10-kDa y/o PEG-DA d.

2. kDa.

27. La composición de material de la reivindicación 25, en la que una proporción molar entre dicho PEG-DA y dicho 20 fibrinógeno es de 2-400 a 1, respectivamente.

28. La composición de material de la reivindicación 22, en la que dicho fibrinógeno es fibrinógeno completo o fibrinógeno fragmentado.