Procedimiento para la purificación de triglicéridos que contiene ácido estearidónico en posición sn-2.

La invención se refiere a un procedimiento para la purificación de TGs ricos en SDA en posición sn-2 mediante cromatografía en columna gravimétrica, a un extracto de TGs ricos en SDA en posición sn-2 obtenido mediante dicho procedimiento y su uso en la industria.

Procedimiento para la purificación de triglicéridos que contienen ácido estearidónico en posición sn-2.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento encuadrado en el sector técnico de la obtención de triglicéridos (TGs) enriquecidos en ácido estearidónico (SDA, 18:4n-3) en posición sn-2.

Estado de la técnica

Los ácidos grasos poliinsaturados, o PUFAs, son moléculas orgánicas consistentes en una cadena hidrocarbonada de 18 o más átomos de carbono con dos o más insaturaciones carbono-carbono en su estructura y un grupo carboxilo al extremo de la misma. La manera más general de proceder a su anotación consiste en una cifra que indica el número de átomos de carbono de su molécula, seguido por dos puntos y el número de insaturaciones que posee. A continuación aparece una "n" en cursiva, un guión y un número indicativo de la posición de las insaturaciones en la cadena. En los aceites y grasas naturales de origen vegetal y animal, estos PUFAs se encuentran mayoritariamente esterificados con moléculas de glicerol dando lugar a los triglicéridos (TGs). Una vez que los TGs son ingeridos por los seres humanos, son degradados metabólicamente hasta sn-2 monoglicéridos y ácidos grasos libres, siendo de esta forma absorbidos por la mucosa intestinal.

Es ampliamente conocida la acción beneficiosa de una variedad de PUFAs sobre la salud. Entre los más conocidos figuran los ácidos gamma-linolénico (GLA, 18:3n-6), ácido estearidónico (SDA, 18:4n-3), eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3) y docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3). El poder purificar TGs que contengan este tipo de compuestos podría permitir su aplicación en fórmulas farmacológicas y/o alimentarias sin tener que recurrir a la incorporación del aceite en su totalidad, con los consecuentes beneficios de una ingesta de menor aporte calórico.

En el estado de la técnica se han conseguido purificar TGs que contienen PUFAs de interés a partir de sus fuentes naturales mediante los procedimientos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y de cromatografía en capa fina (TLC) (Christie, W.W., 1999. Ind. Crop. Prod. 10: 73-83; Redden, P.R., Huang, Y.S., Lin, X. and Horrobin, D.F. 1995. J. Chrom. A 694:381-389). Sin embargo, aunque estas metodologías posibilitan la purificación a escala analítica o semipreparativa, no son adecuadas para las necesidades de la industria, que precisa métodos operativos a mayor escala.

El procedimiento de purificación de componentes de aceites y grasas por columna cromatográfica gravimétrica ha sido aplicado con éxito para la purificación de ésteres metílicos de ácidos grasos. No obstante, supone además una herramienta útil a la hora de fraccionar TGs, presentando ciertas ventajas como su reducido coste, sus posibilidades de escalado y su facilidad de uso (no siendo necesaria una preparación especialmente específica del operario) frente a otras técnicas anteriormente citadas como HPLC, más costosas y que requieren una preparación previa más exhaustiva por parte del personal encargado de su manejo.

En lo que se refiere a la base del funcionamiento del procedimiento en dichas columnas, los ácidos grasos se separan en función del número y configuración de los dobles enlaces debido a que los iones de plata interaccionan reversiblemente con los dobles enlaces para formar complejos polares doble enlace-Ag⁺. Por tanto, a mayor número de dobles enlaces más fuertemente es retenido el ácido y mayor es el tiempo de elución. (Ryu, S., Lee, J., Jeong, B and Hur, H. 1997. US Patent 5.672.726).

Así pues, la separación de mezclas artificiales de TGs utilizando una fase estacionaria de gel de sílice y nitrato de plata, ya ha sido utilizada anteriormente pero, sin embargo, no ha sido ensayada para separar TGs enriquecidos en SDA a partir de fuentes naturales (Vries, B., 1964. J. Am. Oil Chem. Soc. 41:403-406). Esta técnica se ha utilizado previamente para separar exitosamente TGs ricos en DHA de otros TGs (Monsanto Co, 2002. US Patent 6399803), así como para conseguir fracciones de TGs enriquecidas en GLA en posición sn-2 a partir de aceite de fuentes naturales (Gil-Guerrero, J.L. y Rincón Cervera, M.A., 2009). Por otra parte, el uso de este tipo de columna, formada por cationes y gel de sílice, también se ha utilizado para separar fracciones de TGs con distinto índice de yodo, pero no fue ensayada para separar TGs estructurados conteniendo ácidos grasos específicos (Logan, T.D., 1982. EP0062114).

Sería por lo tanto deseable desarrollar un procedimiento para aislar TGs ricos en SDA en posición sn-2 a escala industrial.

Estos TGs son biodisponibles en el organismo humano, ya que las lipasas actúan preferentemente en posición sn-1 y sn-3, con lo que los sn-2 monoglicéridos conteniendo SDA remanentes en el aparato digestivo, pueden ser fácilmente absorbidos por la mucosa intestinal, incorporándose al sistema circulatorio y realizando un amplio número de funciones fisiológicas beneficiosas.

Convenientemente, los TGs ricos en SDA en posición sn-2 pueden ser de utilidad en la formulación de medicamentos, así como en la preparación de complementos nutricionales o alimentos enriquecidos en este tipo de TGs.

Exposición de la invención

Los autores de la presente invención han conseguido desarrollar un procedimiento para obtener un extracto altamente purificado de TGs ricos en SDA en posición sn-2 en base a un proceso de cromatografía en columna gravimétrica en fase normal (CGFN). El procedimiento, objeto de la invención, comprende la elución de un aceite o una mezcla de TGs a través de una columna gravimétrica que contiene una fase estacionaria formada por una mezcla de gel de sílice y nitrato de plata, y una fase móvil de polaridad variable constituida por una mezcla de solventes que comprende hexano, acetona y etanol en unas proporciones que varían en función de la naturaleza del aceite de partida utilizado para la purificación de TGs ricos en SDA.

El objeto de la presente invención es también el extracto de TGs ricos en SDA en posición sn-2 obtenible de acuerdo con el procedimiento inventivo.

Además, la invención se refiere al uso de dicho extracto en la formulación de un medicamento, un producto alimentario enriquecido en TGs con SDA en posición sn-2 o un producto químico destinado a su comercialización con fines de cualquier tipo, por ejemplo como reactivo o intermediario para diferentes tipos de reacciones quími- cas.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención mejora considerablemente la eficacia de los métodos de obtención de los TGs enriquecidos en SDA, que son de empleo común en la industria alimentaria y farmacéutica, y adicionalmente permite disminuir los potenciales peligros para la salud de los TGs obtenidos mediante procesos enzimáticos, en los cuales a veces se utilizan disolventes potencialmente tóxicos para el ser humano. Por otra parte, mediante este método se obtienen TGs enriquecidos en SDA en un proceso significativamente más corto, y por tanto con menores probabilidades de alteraciones oxidativas que en los clásicos, en los cuales interviene un largo número de reacciones enzimáticas.

La presente invención se describirá detalladamente ahora con la divulgación y explicación de los dibujos adjuntos a continuación, en los cuales:

La Figura 1 muestra el esquema del proceso de purificación de TGs en columna cromatográfica gravimétrica con sílice y nitrato de plata como fase estacionaria.

La Figura 2 muestra el perfil de TGs del aceite de E. plantagineum, obtenido por HPLC en fase reversa. Los números 1 y 2 indican las fracciones objeto de la purificación según el método de la invención.

La Figura 3 muestra cromatogramas que corresponden a las fracciones de TGs enriquecidas en SDA. Los números 1 y 2 indican los picos que son purificados por el procedimiento de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de TGs ricos en SDA en posición sn-2 mediante cromatografía en columna gravimétrica en fase normal (CGFN), que comprende:

a) La elución de un aceite o una mezcla de TGs a través de una columna gravimétrica caracterizada porque dicha columna comprende:

1. Procedimiento para la purificación de TGs ricos en SDA en posición sn-2 mediante cromatografía en columna gravimétrica en fase normal (CGFN), que comprende:

a) La elución de un aceite o una mezcla de TGs a través de una columna gravimétrica caracterizada porque dicha columna comprende:

- Una fase estacionaria formada por una mezcla de gel de sílice y nitrato de plata, y

- Una fase móvil de polaridad variable constituida por una mezcla de disolventes que comprende hexano, acetona y etanol en unas proporciones que varían en función de la naturaleza del aceite de partida utilizado para la purificación de TGs ricos en SDA

b) La recuperación de las diferentes fracciones eluídas ricas de TGS con SDA en posición sn-2.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 donde la proporción de hexano en la fase móvil se encuentra entre el 60 y el 94,5%, la de acetona entre el 0,5 y el 30%, y la de etanol entre el 5 y el 30%.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde el aceite o composición de TGs está disuelto en hexano.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la fase estacionaria comprende una mezcla de gel de sílice y nitrato de plata, donde la proporción masa/masa del nitrato de plata respecto al sílice está comprendida entre el 1 y el 50%.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el aceite usado para la purificación es de origen microbiológico, vegetal o animal.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 donde el aceite se selecciona a partir de fuentes de diversa procedencia: microalgas, tales como Isochrysis spp. y Pavlova lutheri, hongos, tales como Thamnidium elegans y aceites de semilla, tales como semillas de araucariáceas, borragináceas, cariofiláceas, cannabináceas, primuláceas y saxífragas.

7. Extracto de TGs ricos en SDA en posición sn-2 obtenible de acuerdo a un procedimiento que se desarrolle de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Uso de un extracto de acuerdo con la reivindicación 7 en la formulación de un medicamento.

9. Uso de un extracto de acuerdo con la reivindicación 7 en la preparación de un producto alimentario enriquecido en TGs con SDA en posición sn-2.

10. Uso de un extracto de acuerdo con la reivindicación 7 como reactivo o intermediario químico.