Procedimiento para la propagación in vitro del espárrago.

Procedimiento de propagación de espárrago (del género Asparagus) mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

Se describe un procedimiento de propagación in vitro del espárrago enfocado hacia el acortamiento del proceso de micropropagación conforme y hacia la obtención de un método eficaz y consistente, que nos permita obtener unos altos porcentajes de éxito en la clonación para una mayoría de genotipos, y reducir el tiempo necesario para la obtención de copias clónales de genotipos agronómicamente interesantes.

El procedimiento de propagación in vitro del espárrago objeto de la presente invención consiste en el cultivo y desarrollo de estructuras gemantes ya preexistentes en el rizoma, cultivándose yemas axilares que ofrecen por ello una mejor garantía de estabilidad somacional, asimismo las raíces se forman a partir de un tejido de parénquima que se conserva en la parte basal de la zona gemante del rizoma que se utiliza como explanto. El procedimiento objeto de la presente invención, probado en genotipos muy diferentes incluyendo incluso una especie silvestre de espárrago A. maritimus, una variedad población ("Morado de Huétor") y varios cultivares de Asparagus officinalis ("UC-157", "Baitoru", y "Atlas") funciona bien en todos los genotipos evaluados y alcanza además unos rendimientos de enraizado bastante altos en todos los genotipos ensayados y en un periodo de tiempo bastante corto, obteniéndose plántulas de 3-4 semanas y en 6-8 semanas plantas de calidad y características idóneas para su trasplante y aclimatación, con un elevado rendimiento en la recuperación de plántulas de calidad al final del proceso de micropropagación.

Procedimiento para la propagación in vitro del espárrago.

Sector de la técnica

Agricultura.

Sector viverista: Procedimiento de propagación de espárrago (del género Asparagus) mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

Estado de la técnica

El espárrago cultivado (Asparagus officinalis L.) es una especie monocotiledónea perteneciente a la familia de las Liliaceas, originaria del próximo oriente y desde hace al menos dos mil años cultivada como alimento y como planta medicinal. La especie es diploide (n=10), perenne y dioica, y por tanto de fecundación alógama.

A nivel mundial, el cultivo del espárrago es de gran importancia económica siendo su superficie cultivada similar al de otras hortalizas como ajo, pimiento, zanahoria o berenjena. La producción mundial de espárrago es de 6.657.000 tm siendo China el mayor productor con 5.906.000 tm seguido de Perú con 206.000 tm. España es el sexto mayor productor de espárrago con 47.000 tm de las que 16.500 tm se dedican a la exportación (FAO, 2005).

El espárrago es uno de los cultivos hortícolas de regadío de mayor interés económico en España, tanto por su consumo a nivel nacional, como por sus posibilidades de exportación en fresco a otros países de la UE, en fechas en las que prácticamente no hay producción en otras áreas de Europa, y tiene gran importancia social debido al elevado número de jornales que requiere su recolección y manipulación posterior, en épocas del año con altos niveles de desempleo en el sector agrícola. En España, como en otros países mediterráneos, también se consumen especies silvestres de espárrago Asparagus albus L., Asparagus acutifolius L. o Asparagus aphylus L., que crecen espontáneamente en Cataluña, Aragón y Andalucía.

El espárrago (género Asparagus) es una especie que normalmente se multiplica mediante semillas y en ocasiones por división vegetativa de su rizoma. La tradicional propagación por semillas puede producir plantaciones con una gran variabilidad genética y por lo tanto plantaciones con una productividad limitada y heterogénea al no presentar todos los individuos una calidad uniforme. La opción de una división vegetativa para la multiplicación del espárrago, tiene habitualmente un rendimiento muy bajo, requiere una gran cantidad de mano de obra para su realización y puede favorecer la transmisión de enfermedades, lo que hace este método muy poco rentable para las empresas viveristas productoras de plantones de espárrago.

Para solucionar estos problemas y tener un sistema fiable para la propagación clonal masiva de genotipos de calidad en espárrago, se han aplicado dos técnicas alternativas de cultivo de tejidos vegetales in vitro, que son el desarrollo de embriones somáticos y la micropropagación clonal conforme. Ambos métodos tienen sus ventajas e inconve- nientes.

El desarrollo de embriones somáticos consiste en la inducción in vitro mediante reguladores de crecimiento (auxinas) de unas estructuras adventicias de tipo bipolar, es decir con un meristemo caulinar y otro meristemo opuesto radicular y por lo tanto muy parecidas a un embrión zigótico, pero originadas a partir de células somáticas. Este método presenta problemas de conversión en planta, debidos a problemas en la maduración de los embriones somáticos y generación de procesos de embriogénesis secundaria cíclica y por derivación de los cultivos a la formación de tejidos de callo; también presenta problemas de inducción de variabilidad genética no deseada que se produce debido a la agresividad de los métodos utilizados en la inducción de la embriogénesis somática y que resulta en la proliferación de estructuras embriogénicas anormales y fuera de tipo no utilizables a efectos de propagación, además, para la producción en masa de embriones somáticos es necesario un equipamiento técnico complejo (bioreactores).

La micropropagación clonal del espárrago para obtener copias conformes de genotipos específicos, se realiza mediante técnicas como el cultivo de meristemos y el cultivo de secciones nodales con yemas axilares. Este método tiene la desventaja de ser un método lento e ineficiente y no válido para todos los genotipos.

El cultivo de meristemos de esta especie fue puesto a punto por Murashige et al. (1972) y Hasegawa et al. (1973), obteniendo protocolos de buen rendimiento, aunque la dificultad técnica y la gran cantidad de tiempo necesario para el aislamiento de los meristemos, desaconsejan la aplicación de dichos métodos para su utilización a gran escala por inviables. Posteriormente Yang y Cloré (1.973) desarrollaron técnicas de micropropagación para el espárrago a partir de secciones nodales, consistentes en la inducción de ramificación axilar. Estos trabajos fueron seguidos por otros para mejorar y refinar los diversos aspectos del proceso de micropropagación, así Yang y Cloré (1974a), Chin (1982), Desjardins (1984), Khunachack et al. (1987) y Doré (1988) incluyeron diversos suplementos (sacarosa) y retardantes de crecimiento (Desjardins et al., 1987) en los medios de cultivo con objeto de mejorar las tasas de enraizado y obtener un mayor número de plántulas de buena calidad adecuadas para su aclimatación y transplante. La conjunción de estas técnicas de cultivo de secciones nodales paulatinamente refinadas y mejoradas por estos autores finalmente concluyó en el desarrollo y la publicación de un procedimiento de micropropagación (Desjardins, 1992) que desde entonces es el método utilizado de forma general para la micropropagación clonal del espárrago. Este procedimiento de micropropagación (Desjardins, 1992) presenta varios problemas: no es aplicable a todas las variedades y especies de espárrago y en muchos casos cuando el procedimiento funciona lo hace con un rendimiento muy bajo en lo que se refiere a la capacidad de inducción di novo de zonas gemantes análogas a las garras (crowns) que se producen de forma natural en el rizoma, y a la capacidad de enraizado de estas zonas gemantes. Además este proceso de formación de zonas gemantes di novo y el enraizado precisa de mucho tiempo para su desarrollo y la obtención de plántulas (de 4 a 14 meses dependiendo del genotipo) y en muchos casos también se encuentran problemas en la aclimatación de dichas plántulas micropropagadas, posiblemente por falta de calidad de las plantas recuperadas tras el largo proceso de micropropagación, que requiere la utilización de al menos dos medios diferentes para su realización. Es decir que el método de micropropagación de Desjardins (1992) es utilizable pero es un método lento, dependiente del genotipo, de bajo rendimiento y con unos resultados muy erráticos ya que depende de la inducción y formación di novo de una estructura gemante adventicia y de un enraizado posterior lo que se suele producir de forma impredecible y errática, lo que complica enormemente la programación de un trabajo de micropropagación, y de hecho limita su aplicación a unos pocos genotipos con excelente comportamiento morfogenético in vitro.

La patente de Yukimasa et al. (1990) propone la utilización de crowns o explantos de zoca (nudos gemantes), previamente inducidos in vitro a partir de un explanto de sección nodal de turión, brote aéreo joven sin ramificación axilar, recién brotado desde el rizoma, para realizar la micropropagación en masa de espárrago.

El procedimiento objeto de la presente invención trata exactamente de evitar la fase de inducción de zonas gemantes in vitro, puesto que este es el cuello de botella tanto de este método (Yukimasa et al., 1990) como del método de Desjardins (1992) y métodos anteriores. Todos estos métodos implican la inducción adventicia de estructuras gemantes y por lo tanto pueden ocasionar variaciones somaclonales que modifiquen el genotipo original, es decir que podrían comprometer la micropropagación clonal. Y además es necesario, en muchos casos, inducir de forma adventicia el enraizado del material y en muchas ocasiones y dependiendo del genotipo, los porcentajes de enraizado son bajos e incluso nulos y requieren de un largo periodo de cultivo in vitro en muchos casos superior a 6 meses. En el método de Yukimasa et al. (1990) el tiempo mínimo que los autores proponen para obtener una plántula susceptible de ser transplantada y aclimatada es de 8 semanas sin incluir ningún tiempo de endurecimiento, además todos los trabajos de micropropagación se realizan con el cultivar Hokkai 100,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

2. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicha preparación de explantos y desinfección (i) comprende las siguientes etapas:

3. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con fungicida (i.iii) se realiza con un fungicida cuya materia activa puede ser Benomilo u otros de similares características a una concentración entre el 0.05 y el 1%, durante un tiempo entre 10 y 40 minutos en agitación.

4. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con fungicida (i.iii) se realiza con un fungicida a base de Benomilo a una concentración del 0.1%, durante un tiempo entre 20-30 min. en agitación.

5. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.v) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración entre el 0.5 y el 3%, durante un tiempo entre 10 y 25 minutos en vacío.

6. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.v) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración del 2%, durante un tiempo de15 minutos en vacío.

7. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha extracción y disección de las yemas del rizoma (i.vi) se realiza eliminando capas de brácteas hasta que su tamaño queda entre 1 y 3 mm.

8. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha separación de las yemas (i.vi) se realiza dejando una yema con varias brácteas, con su correspondiente meristemo apical y un trozo de tejido parenquimático en la base de la misma.

9. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento antioxidante (i.viii) se realiza colocando las yemas en una solución antioxidante mientras paulatinamente se procede a su disección.

10. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha solución antioxidante (i.viii) está compuesta por ácido ascórbico y ácido cítrico.

11. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha solución antioxidante (i.viii) contiene entre 100 y 250 mg/l de ácido cítrico y entre 50 y 200 mg/l de ácido ascórbico.

12. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento con fungicida (i.ix) se realiza con un fungicida cuya materia activa puede ser Benomilo u otros de similares características a una concentración entre el 0.01 y el 1%, durante un tiempo entre 5 y 30 minutos en agitación.

13. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicho tratamiento con fungicida (i.ix) se realiza con un fungicida a base de Benomilo a una concentración del 0.05%, durante un tiempo entre 10 y 15 minutos, en agitación.

14. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.xi) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración entre el 0.5 y el 3%, durante un tiempo entre 10 y 25 minutos en vacío.

15. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dicha desinfección con solución desinfectante (i.xi) se realiza con una solución de hipoclorito sódico a una concentración del 2%, durante 15 minutos en vacío.

16. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 2 caracterizado porque dichos lavados finales (i.xii) se realizan mediante 3 lavados de 5 minutos con agua estéril y en condiciones asépticas en la cabina de flujo laminar.

17. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicho pretratamiento (ii) se realiza utilizando una solución compuesta por una formulación mineral MS suplementada con sacarosa y ácido naftalénico (ANA) ajustada a pH adecuado y estéril, durante un tiempo variable entre 30 minutos y 2 horas.

18. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizada porque dicho pretratamiento (ii) se realiza utilizando una solución compuesta por una formulación mineral MS suplementada con sacarosa en una concentración entre 20 g/l y 80 g/l, y una concentración de ácido naftalénico (ANA) entre 3 g/l y 20 g/l ajustada a pH entre 5 y 6, de acuerdo con las necesidades de cada genotipo a propagar, durante 1 hora.

19. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza durante un periodo de mínimo de 6 semanas incubando los explantos en un medio MS basal, suplementado con las vitaminas de Nitsch y Nistch (1989), i-inositol, tiamina, ancymidol, una combinación de citoquininas, auxinas, ancymidol y sacarosa, en cámara de cultivo con las condiciones adecuadas de luz y temperatura, hasta que las plántulas obtenidas adquieren un tamaño mínimo de entre 10 y 15 cm.

20. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza en un medio basal MS suplementado con las vitaminas de Nitsch y Nitsch (1989) y agar (entre 5 y 10 g/l), i-inositol (entre 50 y 150 mg/l), tiamina (entre 50 y 150 mg/l), ancymidol (entre 0.3 y 4 mg/l) y una combinación de auxinas y citoquinas, elegida entre cualquiera de las combinaciones ANA más kinetina, ANA más kinetina mas 2iP e incluso ANA o AIA sin citoquininas y suplementado con sacarosa,

21. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 19 y 20 caracterizado porque los rangos de concentración de dicha combinación de auxinas y citoquininas se encuentran entre los siguientes: para el AIA entre 0,05 y 1 mg/l, para 2iP entre 0,1 y 1 mg/l, para ANA entre 0,05 y 1 mg/l, para kinetina entre 0,05 y 1 mg/l y para sacarosa entre 30 y 60 g/l.

22. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque las proporciones de dicha combinación de auxinas más citoquininas se realiza utilizando proporciones entre ANA y kinetina según cualquiera de las combinaciones 1:1, 3:5, 3:7, 5:7, 5:10 ó 6:10.

23. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 caracterizado porque dicho establecimiento del explanto e incubación para la multiplicación (iii) se realiza durante un periodo de entre 6-10 semanas, en cámara de cultivo a 25\pm1ºC, una intensidad luminosa de 42 μE m² s^-1 y un fotoperiodo de 16 horas de luz 8 h de oscuridad.

24. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación 1 caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza durante un periodo de entre 3 y 5 semanas, colocando las plántulas en macetas con sustrato preparado a base de una mezcla de turba y perlita, con fertilizante de liberación lenta en cantidad adecuada, e incubadas en túneles de aclimatación provistos de un sistema de niebla artificial sobre bancadas con calefacción.

25. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza utilizando un sustrato con una mezcla de turba y perlita en proporción 7:3, añadiendo unos 20 gránulos por maceta de fertilizante de liberación lenta (tipo Ficote), e introducción de las plántulas en túneles de aclimatación. A continuación las plántulas se someten a periodos sucesivos de disminución de la humedad mediante apertura de la cubierta del túnel, e incrementando los tiempos de apertura paulatinamente a medida que avanza el proceso de aclimatación.

26. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 caracterizado porque dicha aclimatación (iv) se realiza aplicando una vez por semana un tratamiento fitosanitario de tipo preventivo con un fungicida sistémico tipo Benomilo a una concentración 50% p/p y riego de plantas con agua corriente.

27. Procedimiento de propagación in vitro del espárrago según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

28. Aplicación del procedimiento de propagación in vitro del espárrago según reivindicación anterior a cualquier especie cultivada o silvestre del genero Asparagus o a cualquier variedad o genotipo de espárrago.

29. Espárragos de cualquier variedad o genotipo así como de cualquier especie cultivada o silvestre propagados in vitro mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.