Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, que usa cepas de la familia de las Enterobacteriáceas.

Procedimiento para la preparación de L-treonina o L-lisina por fermentación de microorganismos recombinantesde la familia de las Enterobacteriáceas,

en el que

a) los microorganismos, que producen el deseado L-aminoácido y en los que el gen eno o las secuencias denucleótidos o los alelos que codifican una proteína con la actividad de una enolasa, se intensifican, y secultivan en un medio en unas condiciones en las que el deseado L-aminoácido es concentrado en el medioo en las células, y

b) el deseado L-aminoácido es aislado, quedando en el producto que ha sido aislado o siendo eliminadoscompletamente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones(≥ 0 a 100 %) del mismo,

en el que una intensificación describe la actividad o concentración intracelular aumentada de dicha proteína por almenos un 10 % basada en la de la proteína de tipo silvestre o en la de la cepa parental.

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, que usa cepas de la familia de las Enterobacteriáceas Campo del invento Este invento se refiere a un procedimiento para la preparación de L-treonina y L-lisina, que usa microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas, en el que el gen eno es intensificado, en particular sobreexpresado, y a estos microorganismos.

Antecedentes del invento Los L-aminoácidos, en particular la L-treonina, se usan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de los alimentos y muy particularmente en la nutrición de animales.

Es conocido que se preparan L-aminoácidos por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular de Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. A causa de su gran importancia, constantemente se están emprendiendo trabajos para mejorar los procesos de preparación. Los mejoramientos en los procesos se pueden relacionar con medidas técnicas de fermentación, tales como p.ej. agitación y suministro de oxígeno, o con la composición de los medios nutrientes, tales como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o la elaboración a la forma de un producto, p.ej. por cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento de producción del microorganismo propiamente dicho.

Se usan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes para mejorar las propiedades de rendimiento de producción de estos microorganismos. Se obtienen de esta manera unas cepas que son resistentes a unos antimetabolitos, tales como p.ej. el compuesto análogo a treonina ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHV) , o son auxótrofas para metabolitos que tienen importancia reguladora y que producen L-aminoácidos tales como p.ej. Ltreonina.

También se han empleado desde hace algunos años métodos de la tecnología del ADN recombinante para mejorar la (s) cepa (s) de la familia de las Enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos, por amplificación de genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos y por investigación del efecto sobre la producción. Una información recopiladora de la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se puede encontrar en la cita de Neidhardt (coordinador de edición) : Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (Escherichia coli y Salmonella, biología celular y molecular) , 2ª edición, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU. (1996) .

El documento de patente EP 1 382 685 A2 (de DEGUSSA AG, 21.01.2004) describe un procedimiento para la producción por fermentación de L-treonina, que emplea microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas, en el que la productividad de L-treonina de una cepa de Escherichia coli ha sido mejorada por intensificación de la actividad de la proteína RseB.

Objeto del invento El objeto del invento es proporcionar nuevas medidas técnicas para una mejorada preparación por fermentación de L-treonina y L-lisina.

Sumario del invento Se describen unos microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas, que contienen un gen eno intensificado o sobreexpresado, que codifica una enolasa, o alelos del mismo, y que produce L-treonina y Llisina de una manera mejorada.

El punto de partida para la comparación lo constituyen en cada caso los microorganismos que no son recombinantes para el gen eno y que no contienen ningún gen eno intensificado.

Estos microorganismos incluyen, en particular, unos microorganismos de la familia de las Enterobacteriáceas, en los que es intensificado un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en el grado de por lo menos 90 %, en particular en el grado de por lo menos 95 %, de manera preferible en el grado de por lo menos 98 % o de por lo menos 99 %, de manera particularmente preferida en el grado de 99, 7 % y de manera muy particularmente preferible en el grado de 100 %, a una secuencia de aminoácidos escogida a partir del conjunto que consiste en SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, y SEQ ID No. 8.

Se prefieren unas secuencias de aminoácidos que son idénticas a las de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No.

8.

Los microorganismos mencionados contienen polinucleótidos intensificados o sobreexpresados, escogidos entre el conjunto que consiste en:

a) un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro del contexto de la degeneración del código genético;

c) una secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia complementaria con respecto a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;

d) un polinucleótido con una secuencia de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 que contiene mutantes con sentido de función neutra, en donde los polinucleótidos codifican una enolasa.

El invento proporciona un procedimiento para la preparación por fermentación de L-treonina y L-lisina, que usa microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas que, en particular, ya producen los Laminoácidos, y en el que por lo menos se intensifica (n) el gen eno o las secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico del mismo.

Descripción detallada del invento Se emplean preferiblemente los microorganismos descritos.

Cuando se mencionan unos L-aminoácidos o aminoácidos, en lo sucesivo esto significa uno o más aminoácidos, incluyendo a sus sales, que se escogen entre el conjunto que consiste en L-treonina y L-lisina. Se prefiere particularmente la L-treonina.

El término “intensificación” en este contexto describe el aumento en la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo, que son codificadas por el correspondiente ADN, por ejemplo aumentando el número de copias del gen o de los genes por al menos una (1) copia, engarzando un potente promotor funcionalmente con el gen o usando un gen o alelo que codifica una correspondiente enzima o proteína con una alta actividad, y combinando opcionalmente estas medidas técnicas.

Los alelos se entienden en general como que significan formas alternativas de un gen dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de nucleótidos.

La proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir un ORF (cuadro de lectura abierto) , un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado, se denomina en general el producto génico.

Por medidas técnicas de intensificación, la actividad o concentración de la correspondiente proteína se aumenta en general por al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, hasta un máximo de un 1.000 % o 2.000 %, basándose en la de la proteína de tipo silvestre o en la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental que no es recombinante para la correspondiente enzima o proteína. Se entiende que un microorganismo o cepa parental que no es recombinante significa el microorganismo en el que se llevan a cabo las medidas técnicas.

El invento proporciona un procedimiento para la preparación de L-treonina o L-lisina por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas, caracterizado porque a) los microorganismos de la familia de las Enterobacteriáceas, que producen el deseado L-aminoácido y en los que el gen eno o sus alelos es/son intensificado (s) , en particular sobreexpresado (s) , se cultivan en un medio en unas condiciones apropiadas para la formación del producto del gen eno, b) el deseado L-aminoácido es concentrado en el medio o en las células de los microorganismos, y c) el deseado L-aminoácido es aislado, quedando en el producto que ha sido aislado o siendo completamente retirados ciertos constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (de ≥ 0 a 100 %) .

Los microorganismos recombinantes con un gen eno intensificado pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente un almidón, opcionalmente una celulosa o a partir de glicerol y etanol. Ellos son representantes de la familia de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de L-treonina o L-lisina por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia de las Enterobacteriáceas, en el que a) los microorganismos, que producen el deseado L-aminoácido y en los que el gen eno o las secuencias de nucleótidos o los alelos que codifican una proteína con la actividad de una enolasa, se intensifican, y se cultivan en un medio en unas condiciones en las que el deseado L-aminoácido es concentrado en el medio o en las células, y b) el deseado L-aminoácido es aislado, quedando en el producto que ha sido aislado o siendo eliminados completamente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (≥ 0 a 100 %) del mismo, en el que una intensificación describe la actividad o concentración intracelular aumentada de dicha proteína por al menos un 10 % basada en la de la proteína de tipo silvestre o en la de la cepa parental.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se intensifica un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en un grado de por lo menos 90 % a una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto que consiste en SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, y SEQ ID No. 8.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los microorganismos contienen un polinucleótido sobreexpresado o intensificado, que corresponde al gen eno, escogido entre el conjunto que consiste en:

a) un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7; dentro del contexto de la degeneración del código genético;

c) una secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia complementaria con respecto a la SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;

d) un polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 que contiene mutantes con sentido de función neutra.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en el grado de por lo menos 95 % a una de las secuencias escogidas entre el conjunto que consiste en SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, y SEQ ID No. 8.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100 % a la de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.

6. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que los microorganismos se producen por transformación, transducción o conjugación, o por una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el gen eno, un alelo de este gen o partes del mismo y/o un promotor.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 6, en el que el número de copias del gen eno o de los alelos es aumentado por al menos 1.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el aumento en el número de copias del gen eno por al menos 1 es efectuado por integración del cuadro de lectura abierto (ORF) o de los alelos dentro del cromosoma de los microorganismos.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el aumento en el número de copias del gen eno por al menos 1 se consigue por medio de un vector que se replica extracromosomalmente.

10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que, para conseguir la intensificación,

a) la región de promotor y de regulación o el sitio de fijación de ribosomas situado corriente arriba del gen eno es mutada/o o b) unos casetes de expresión o promotores son incorporados corriente arriba del gen eno.

11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el gen eno está puesto bajo el control de un promotor que intensifica la expresión del gen.

12. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 11, en el que la concentración o actividad del producto del gen eno es aumentada por sobreexpresión del gen eno o de las secuencias de nucleótidos o los alelos que codifican el producto génico del mismo.

13. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 12, en el que los microorganismos se escogen a partir del género Escherichia.

14. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 13, en el que los microorganismos se escogen a partir de la especie Escherichia coli.

15. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 14, en el que, para la preparación de L-treonina, unos microorganismos de la familia de la Enterobacteriáceas son fermentados y en el que adicionalmente, al mismo tiempo, uno o más de los genes escogidos entre el conjunto que consiste en:

15.1 por lo menos un gen del operón thrABC que codifica la aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa, la homoserina cinasa y la treonina sintasa,

deshidrogenasa, 15.30 el gen sucC que codifica la sub-unidad β de la succinil-CoA sintetasa, 15.31 el gen sucD que codifica la sub-unidad α de la succinil-CoA sintetasa, 15.32 el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo de la piruvato deshidrogenasa, 15.33 el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo de la piruvato deshidrogenasa, 15.34 el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE, 15.35 el producto génico del cuadro de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli, y

15.36 el producto génico del cuadro de lectura abierto (ORF) yaaU de Escherichia coli es o son intensificados, en particular sobreexpresados.

16. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 15, en el que, para la preparación de L-treonina, se fermentan unos microorganismos de la familia de las Enterobacteriáceas, en que adicionalmente, al mismo tiempo, uno o más de los genes escogidos entre el conjunto que consiste en:

16.1 el gen tdh que codifica la treonina deshidrogenasa, 16.2 el gen mdh que codifica la malato deshidrogenasa, 16.3 el producto génico del cuadro de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli, 16.4 el producto génico del cuadro de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli, 16.5 el gen pckA que codifica la fosfoenol piruvato carboxicinasa, 16.6 el gen poxB que codifica la piruvato oxidasa, 16.7 el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa, 16.8 el gen fruR que codifica el represor de fructosa, 16.9 el gen rpoS que codifica el factor sigma38, y 16.10 el gen aspA que codifica la aspartato amonio liasa es o son atenuados, en particular eliminados o reducidos en su expresión.

Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99Aeno.