Kit de test para detectar enfermedad periodontal.

Un kit de test para detectar la enfermedad periodontal en un paciente por análisis de una muestra de la cavidadoral del paciente,

en el cual dicho kit comprende al menos:

un primer ensayo de detección para detectar una primera sustancia originaria de bacterias, comprendiendodicho primer ensayo de detección:

i. un primer anticuerpo que exhibe fijación selectiva a dicha primera sustancia, y

ii. medios para generar una respuesta detectable,

siendo dicha primera sustancia arg-gingipaína de Porphyromonas gingivalis, yun segundo ensayo de detección para detectar una segunda sustancia originaria del sistema inmunitario oinflamatorio del paciente, comprendiendo dicho segundo ensayo de detección:

i. un segundo anticuerpo que exhibe fijación selectiva a dicha segunda sustancia, y

ii. medios para generar una respuesta detectable,

siendo dicha segunda sustancia una elastasa de los neutrófilos humanos.

Kit de test para detectar enfermedad periodontal

Campo Técnico La presente invención se refiere a un kit de test para detectar enfermedad periodontal. La presente descripción se 5 refiere adicionalmente a un método para la diagnosis y predicción del riesgo progresión de enfermedad periodontal.

Antecedentes de la Técnica La periodontitis afecta aproximadamente al 7-15% de los adultos en el mundo occidental, lo que hace de ella una de las enfermedades más comunes. Es una enfermedad multifactorial en la que la presencia de bacterias patógenas en una bolsa entre el diente y la encía es un criterio necesario pero no suficiente. Los sistemas inflamatorio e inmunitario del hospedador juegan también un papel crucial en el desarrollo de la enfermedad. Se cree que la progresión de la periodontitis es una respuesta inflamatoria crónica a bacterias subgingivales, que da como resultado la destrucción de los tejidos de soporte del diente. Es cíclica en su comportamiento y puede permanecer inadvertida en su fase inicial.

Se cree que el proceso destructivo es el resultado de una interacción compleja entre el sistema de defensa del

hospedador y especies bacterianas específicas en la bolsa periodontal. Las bacterias patógenas implicadas en la aparición y la progresión de la enfermedad periodontal incluyen, pero sin carácter limitante, Porphyromonas gingivalis (anteriormente Bacteroides gingivalis) , Bacteroides forsythus (denominada también ahora Tannerella forsythensis) , Actinobacillus actinomycetemcomitans, Triponema denticola y Prevotella intermedia.

En los últimos años ha sido estudiada detalladamente la importancia de los productos de virulencia de las bacterias (principalmente toxinas y enzimas) , y se cree que juega un papel principal en la patogénesis (Eley y Cox (2003) ) . Se cree que las bacterias pasan por fases de crecimiento diferentes y durante estas fases son más o menos destructivas en la bolsa periodontal. Las bacterias activas originan productos de virulencia que favorecen su supervivencia y nutrición en la bolsa periodontal. Durante los periodos de actividad bacteriana elevada, dichos productos de virulencia contribuyen a la destrucción de los tejidos de soporte del diente y la reducción en la eficacia de los sistemas de defensa del hospedador.

Los dentistas actuales evalúan la periodontitis por medición de la profundidad de sonda de la bolsa periodontal, examinando imágenes de rayos X de la fijación del diente al hueso alveolar, y hacen referencia a la hemorragia durante el sondeo. Los factores de riesgo incluyen hábitos de fumar, estrés e historia familiar de periodontitis. El método está basado sólidamente en la experiencia subjetiva del dentista. La profundidad de la sonda es solamente una medida de la pérdida de fijación histórica, aportando así escaso apoyo a la existencia real de la periodontitis o la progresión futura de la misma. La hemorragia durante el sondeo podría indicar un proceso de curación en lugar de un proceso destructivo.

Ocasionalmente, se toma una muestra microbiológica y se envía a un laboratorio para análisis sea por cultivo o técnicas de DNA (técnica de hibridación Checkerboard DNA-DNA desarrollada por Socransky (1994) ) . Sin embargo,

la respuesta se obtiene en un tiempo aproximado de una semana y muestra únicamente la presencia de ciertas bacterias, lo cual no indica necesariamente periodontitis.

Se han realizado cantidades enormes de trabajo para encontrar un compuesto químico, principalmente una proteína, tal como una enzima o una citoquina, en fluidos procedentes de la cavidad oral de un paciente, tales como el fluido gingival crevicular (GCF) , que pueda diagnosticar o predecir la progresión de la periodontitis.

Hasta ahora se han desarrollado varios tests y ensayos (Armitage (2003) ) . Estos ensayos se han dedicado a identificar bacterias, productos de virulencia bacterianos o proteínas del hospedador.

Las proteínas derivadas del hospedador que se han investigado por su valor de diagnóstico o pronóstico en la periodontitis incluyen principalmente productos del sistema inflamatorio humano. El papel de estas proteínas es orquestar la respuesta inflamatoria e inmunitaria, remodelar el tejido o ayudar a la destrucción de las bacterias 45 invasoras.

Las proteínas más estudiadas derivadas del hospedador que se han propuesto para diagnóstico de la periodontitis incluyen las serina-proteasas naturales (catepsina G, azurocidina, proteinasa 3, elastasa) , colagenasa, aminotransferasas (Patentes US Nos. 4.981.787, 5.834.226 y 4.801.535) , fosfatasa alcalina, β-glucuronidasa (Patente US No. 6.277.587) , dipeptidil-peptidasa, lipocalina relacionada con la gelatinasa de los neutrófilos (Patente 50 US No. 5.866.432) , metaloproteinasas de la matriz (Patentes US Nos. 5.736.341 y 6.280.687) y citoquinas tales como interleuquinas (especialmente IL-1β (Patente US No. 5.328.829) , IL-6 e IL-8) y mediadores inflamatorios tales como prostaglandina E2 y el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α) .

Se han sugerido metaloproteínas de la matriz (MMP's) como marcador de la enfermedad periodontal. La patente US No. 5.736.341 describe la detección de la presencia de MMP-8, la patente US No. 5.866.432 describe la detección de la presencia de la lipocalina relacionada con la gelatinasa de los neutrófilos, y la patente US No. 6.280.687 describe la presencia de MMP-13. Estas tres patentes sugieren un test rápido del lado de la silla basado en el principio inmunocromatográfico para la diagnosis y predicción de la progresión de la periodontitis. Sin embargo, en el documento informativo de la Asociación Americana de Periodontología por Oringer (2002) se sostiene que son necesarios estudios adicionales a fin de comprobar el papel de las MMP's en la progresión de la enfermedad periodontal.

La patente US No. 6.406.873 reivindica que dos mediadores inflamatorios (el inhibidor 2 del activador del plasminógeno y el activador del plasminógeno tisular) solos o en combinación pueden diagnosticar la periodontitis.

La patente US No. 5.248.595 describe un método para analizar simultáneamente hasta tres patógenos periodontales 10 diferentes.

Chapple (1997) ha revisado los métodos tradicionales y empleados actualmente de diagnosis periodontal y concluye que la detección de marcadores, tales como la presencia de fosfatasa alcalina en el fluido del espacio subgingival, son más sensibles y específicas en comparación con las evaluaciones clínicas, tales como el análisis del color del tejido, el sondeo de la profundidad de la bolsa y la medida de la movilidad del diente. Chapple concluye también que la combinación de dos o más de tales marcadores puede producir el medio más exacto para la diagnosis de la actividad de la enfermedad en curso o futura, pero no presenta ninguna de tales combinaciones.

Jin et al. (1999) han estado investigando la correlación entre la presencia de patógenos periodontales, es decir bacterias, utilizando métodos de sondeo de DNA, en la bolsa periodontal y elastasa en el fluido del espacio subgingival (GCF) .

Nisengard et al. (1992) han descrito un test rápido de aglutinación de látex para la presencia de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans y P. intermedia.

Lamster et al. (1994) han investigado la pérdida clínica de fijación y su correlación con la β-glucuronidasa de los leucocitos humanos.

Eley y Cox (1996) han desarrollado un test del lado de la silla basado en un sustrato enzimático específico para la 25 gingipaína de P. gingivalis.

US 2002/0012944 (Xiao et al) da a conocer que la existencia y la extensión de la enfermedad periodontal pueden ser diagnosticadas por medida de los niveles del inhibidor 2 del activador del plasminógeno (PAI-2) y/o del activador del plasminógeno tisular (t-PA) en el fluido gingival crevicular (GCF) . Los niveles de PAI-2 y t-PA en GCF aumentan bruscamente en el contexto de la enfermedad periodontal, y están correlacionados también con la gravedad de la enfermedad en sitios diferentes en el mismo paciente.

Okada, H et al (Oral Diseases (1996) 2, 87-95) describen estrategias de diagnóstico basadas en los mecanismos moleculares causantes de la periodontitis. Se estudiaron factores bacterianos tales como células bacterianas y citoquinas o mediadores proinflamatorios. Los autores afirman que los marcadores diagnósticos serían factores patógenos e inflamatorios que participan en la destrucción del tejido conectivo periodontal y el hueso.

En Lee et al (Kaohsiung J Med Sci (2003) 19, 406-414) presenta un estudio de investigación de la activación de procesos inflamatorios en la enfermedad periodontal por evaluación cuantitativa de VEGF, MCP-1 e IL-8... [Seguir leyendo]

1. Un kit de test para detectar la enfermedad periodontal en un paciente por análisis de una muestra de la cavidad oral del paciente, en el cual dicho kit comprende al menos:

un primer ensayo de detección para detectar una primera sustancia originaria de bacterias, comprendiendo 5 dicho primer ensayo de detección:

i. un primer anticuerpo que exhibe fijación selectiva a dicha primera sustancia, y

ii. medios para generar una respuesta detectable, siendo dicha primera sustancia arg-gingipaína de Porphyromonas gingivalis, y un segundo ensayo de detección para detectar una segunda sustancia originaria del sistema inmunitario o inflamatorio del paciente, comprendiendo dicho segundo ensayo de detección:

i. un segundo anticuerpo que exhibe fijación selectiva a dicha segunda sustancia, y

ii. medios para generar una respuesta detectable, siendo dicha segunda sustancia una elastasa de los neutrófilos humanos.

2. Un kit de test de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual cada uno de dichos ensayos de detección primero y 15 segundo proporciona un ensayo inmunocromatográfico.

3. Un kit de test de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un soporte provisto de un depósito de muestra para recibir dicha muestra, en el cual dichos ensayos de detección primero y segundo están dispuestos sobre dicho soporte en contacto con dicho depósito de muestra, directamente o por vía de un medio de separación dispuesto de modo que puede retirarse, que separa dicho depósito de muestra de dichos ensayos de detección.

4. Un kit de test de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tampones adicionales para dilución y adaptación de dicha muestra para dichos ensayos de detección.

5. Un kit de test de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un depósito de tampón separado de dicho depósito de muestra.

6. Un kit de test de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente al menos un dispositivo de muestreo para la obtención de dicha muestra.