Inhibidores peptídicos de permeabilidad celular de la vía de transducción de la se;al de JNK.

Secuencia inhibidora de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos retro-inversa D de acuerdo con laSEQ ID Nº: 2.

Inhibidores peptídicos con permeabilidad celular de la vía de transducción de la señal de JNK

La presente invención se refiere a inhibidores de la proteína-quinasa y, más específicamente, al uso de inhibidores de la proteína-quinasa c-Jun amino terminal. Adicionalmente, la presente invención proporciona secuencias inhibidoras de JNK, péptidos quiméricos y también composiciones farmacéuticas para el tratamiento de fisiopatologías asociadas a la señalización de JNK.

La quinasa c-Jun amino terminal (JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de las proteína-quinasas activadas por mitógeno (MAP) . Estas quinasas se han relacionado con el control del crecimiento y la diferenciación celular y, en general, con las respuestas celulares a estímulos ambientales. La vía de transducción de las señales de JNK se activa en respuesta al estrés ambiental y por la intervención de diversas clases de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citoquina, de serpentina y tirosina-quinasas receptoras. En células de mamífero, la JNK se relaciona con procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y la mediación en respuestas adaptativas al estrés ambiental. La JNK también se asocia a la modulación de las respuestas inmunitarias, incluyendo la maduración y diferenciación de inmunocitos, y con la ejecución de la muerte celular programada en células identificadas para la destrucción por el sistema inmunológico. Esta propiedad única hace que las señales de JNK sean un objetivo prometedor para el desarrollo de una intervención farmacológica. Entre otros trastornos neurológicos, las señales de JNK tienen un papel particular en los ataques isquémicos y la enfermedad de Parkinson.

Una propuesta para combatir aquellos trastornos claramente relacionados con las señales de JNK es la provisión de inhibidores de la vía de señalización de JNK. Estos inhibidores, tal como son conocidos en el estado actual de la técnica, incluyen en particular inhibidores quinasa aguas arriba (por ejemplo CEP-1347) , inhibidores químicos de JNK pequeños (SP600125 y AS601245) que afectan directamente a la actividad quinasa, por ejemplo compitiendo con el sitio de unión del ATP de la proteína-quinasa, e inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (véase, por ejemplo, Kuan y col., Current Drug Targets -CNS & Neurological Disorders, febrero de 2005, vol. 4, nº 1, pp. 63-67 (5) ) .

El inhibidor aguas arriba de la quinasa CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semisintético de la familia de las quinasas de linaje mixto. El CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia neuronal a dosis que inhiben la activación de las quinasas c-Jun amino terminales (JNK) en cultivos embrionarios primarios y células PC12 diferenciadas después de retirada trófica y en ratones tratados con 1-metil-4-feniltetrahidropiridina. Además se ha observado que el CEP-1347 (KT7515) puede promover la supervivencia a largo plazo de neuronas cultivadas simpáticas, ciliares y motoras de los ganglios de la raíz dorsal embrionaria de pollos (véase, por ejemplo, Borasio y col., Neuroreport. 9 (7) : 1435-1439, 11 de mayo de 1998) .

Se ha comprobado que el inhibidor químico pequeño de JNK SP600125 reduce los niveles de fosforilación de c-Jun, protegiendo las neuronas dopaminérgicas frente a la apoptosis, y restaura en parte el nivel de dopamina en caso de enfermedad de Parkinson inducida por MPTP en ratones C57BL/6N (Wang y col., Neurosci Res. Febrero de 2004; 48 (2) ; 195-202) . Estos resultados indican además que la vía de JNK es el principal mediador de los efectos neurotóxicos del MPTP in vivo y que la inhibición de la actividad de JNK puede constituir una estrategia nueva y eficaz para tratar la enfermedad de Parkinson.

Otro ejemplo de inhibidores químicos pequeños es el inhibidor de JNK AS601245 arriba mencionado. El AS601245 inhibe la vía de señalización de JNK y promueve la supervivencia celular después de isquemia cerebral. El AS601245 ha proporcionado in vivo una protección significativa contra la pérdida retrasada de neuronas CA1 hipocampales en un modelo de jerbo de isquemia global transitoria. Este efecto está mediado por la inhibición de JNK y, por consiguiente, por la expresión y fosforilación de c-Jun (véase, por ejemplo, Carboni y col., Pharmacol Exp Ther. Julio de 2004; 310 (1) :25-32. Epub 26 de febrero de 2004) .

Una tercera clase de inhibidores de la vía de señalización de JNK es la de los inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos, tal como se ha menciona anteriormente. Como punto de partida para la construcción de estos péptidos inhibidores de JNK se puede utilizar una alineación de secuencia de proteínas JNK naturales. Típicamente, estas proteínas comprenden dominios de unión de JNK (JBD) y se encuentran en diversas proteínas de unión de insulina (IB) , tales como IB1 o IB2. El resultado de un ejemplo de alineación de secuencia es, por ejemplo, una alineación de secuencia entre los dominios de unión de JNK de IB1 [SEQ ID Nº: 13], IB2 [SEQ ID Nº: 14], c-Jun [SEQ ID Nº: 15] y ATF2 [SEQ ID Nº: 16] (véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1C) . Una alineación de este tipo revela una secuencia de 8 aminoácidos parcialmente conservada (véase, por ejemplo, la figura 1A) . Una comparación de los JBD de IB1 e IB2 revela además dos bloques de siete y tres aminoácidos que están altamente conservados entre las dos secuencias.

Por ejemplo, en el documento WO 01/27268 se dan a conocer secuencias construidas en base a una alineación de este tipo. El documento WO 01/27268 proporciona péptidos de fusión pequeños con permeabilidad celular que comprenden la llamada secuencia de permeabilidad celular TAT derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína VIH-TAT y una secuencia inhibidora de IB1 de un mínimo de 20 aminoácidos. Los dos componentes están unidos entre sí de forma covalente. Ejemplos de inhibidores (y actualmente los únicos) de la vía de señalización de MAPK-JNK descritos en el documento WO 01/27268 son L-JNKI1 (péptido inhibidor de JNK compuesto por aminoácidos L) o péptidos D-JNKI1 resistentes a la proteasa (péptido inhibidor de JNK compuesto por aminoácidos D no nativos) . Estos péptidos inhibidores de JNK (JNKI) son específicos para JNK (JNK1, JNK2 y JNK3) . A diferencia de estos inhibidores de compuestos pequeños arriba indicados, las secuencias inhibidoras indicadas en el documento WO 01/27268, por ejemplo JNKI1, inhiben esencialmente la interacción entre JNK y su sustrato. El péptido de fusión es transportado eficientemente a las células mediante su secuencia de tráfico derivada de TAT. Debido a las nuevas propiedades obtenidas mediante el componente de tráfico, los péptidos de fusión son transportados activamente al interior de las células, donde se mantienen efectivos hasta la degradación proteolítica.

No obstante, los péptidos de acuerdo con el documento WO 01/27268 siguen siendo accesibles por las fosforilasas (quinasas) . Cualquier aminoácido de un péptido diana para quinasas y, por consiguiente, susceptible a fosforilación, representa un factor importante para inactivar estos péptidos. Por ello, un primer objeto de la presente invención es proporcionar nuevas secuencias inhibidoras para la vía de señalización de JNK que conserven las propiedades funcionales de los péptidos descritos en el documento WO 01/27268, pero que proporcionen una mayor estabilidad frente a las fosforilasas (quinasas) .

Además, las secuencias inhibidoras de acuerdo con el documento WO 01/27268 requieren un costoso paso de recuperación y purificación, en particular si se preparan en cantidades a gran escala (por ejemplo, para la producción industrial) . Por consiguiente, un segundo objeto de la presente invención es proporcionar secuencias inhibidoras que posibiliten una producción y una recuperación más sencilla y rentable que las del estado actual de la técnica.

Estos objetos se resuelven mediante una secuencia inhibidora de JNK consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID Nº: 2.

Preferentemente, la secuencia inhibidora de JNK de la invención se une a JNK y/o inhibe la activación de al menos un factor de transcripción activado por JNK, por ejemplo c-Jun o ATF2 (véanse, por ejemplo, SEQ ID Nº: 15 y 16, respectivamente) o Elk1.

La secuencia inhibidora de JNK de la invención está compuesta exclusivamente por aminoácidos D. La secuencia inhibidora de JNK compuesta por aminoácidos D es una secuencia retro-inversa... [Seguir leyendo]

1. Secuencia inhibidora de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos retro-inversa D de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2.

2. Secuencia inhibidora de JNK según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia inhibidora de JNK se une a la quinasa c-jun amino terminal (JNK) .

3. Secuencia inhibidora de JNK según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque la secuencia inhibidora de JNK inhibe la activación de al menos un factor de transcripción dirigido a JNK cuando la secuencia inhibidora de JNK está presente en una célula que expresa JNK.

4. Secuencia inhibidora de JNK según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el factor de transcripción dirigido a JNK se selecciona de entre el grupo consistente en c-Jun, ATF2 y Elkl.

5. Secuencia inhibidora de JNK según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la secuencia inhibidora de JNK altera un efecto de JNK cuando el péptido está presente en una célula que expresa JNK.

6. Péptido quimérico que consiste en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, estando unido el primer dominio al extremo C-terminal del segundo dominio.

7. Péptido según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de tráfico comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.

8. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la secuencia de tráfico comprende la secuencia de L-aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 o 7, o la secuencia retro-inversa D de acuerdo con la SEQ ID Nº: 6 u 8.

9. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la secuencia de tráfico aumenta la absorción celular del péptido.

10. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la secuencia de tráfico dirige la localización nuclear del péptido.

11. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la secuencia inhibidora de JNK comprende la secuencia de aminoácidos D retro-inversa de SEQ ID Nº: 11.

12. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque el péptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos D retro-inversa de SEQ ID Nº: 11.

13. Composición farmacéutica que comprende una secuencia inhibidora de JNK consistente en una secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o en un péptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Utilización de una secuencia inhibidora de JNK según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de un péptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una fisiopatología seleccionada de entre tumores malignos de pulmón, de mama, linfoides, del tracto gastrointestinal y genitourinario y también adenocarcinomas, incluyendo tumores malignos tales como cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago, así como leucemia, cánceres con transformaciones oncogénicas Bcr-Abl, psoriasis, pénfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (SDRA) , enfermedad cardíaca isquémica, síndrome posdiálisis, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, vasculitis, shock séptico, reestenosis, pérdida de audición, traumas del oído, isquemia, apoplejía; lesiones de reperfusión, hipoxia, efectos secundarios debidos a tratamiento con citoquinas proinflamatorias, corazón diabético e hipertrofia cardíaca y lesiones arterioscleróticas, estados patológicos inducidos por radiación ionizante tal como se utiliza en la radioterapia y luz ultravioleta (luz UV) , estados patológicos inducidos por agentes perjudiciales para el ADN, incluyendo fármacos quimioterapéuticos, hipotermia e hipertermia, enfermedades inflamatorias, autoinflamatorias, inmunes y autoinmunes, enfermedades degenerativas, miopatías, cardiomiopatías y rechazo de injertos.

15. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada porque la composición farmacéutica se administra por una vía de administración seleccionada de entre el grupo consistente en las vías intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y en parche.

16. Kit que comprende una secuencia inhibidora de JNK consistente en una secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o un péptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16.

Secuencias de péptidos, humano, ratón y rata

Volumen de lesión mm3

Cambio del umbral dB SPL a8 kHz

Tratado 30 Tratado 30 min. Tratado 4 h Animal de minutos antes después del después del control no del trauma trauma trauma tratado