Incremento de la expresión de secuencias recombinantes en eucariotas.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología, en concreto, la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido que comprende una secuencia de autocorte ribozimático insertada en la secuencia de un intrón nuclear no autocatalítico, para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica aislada en la que a su vez se inserta dicho polinucleótido, respecto de un control y en un sistema de expresión eucariótico. La secuencia nucleotídica aislada que aumenta su expresión como consecuencia de la inserción de dicho polinucleótido, puede codificar para una proteína o para una secuencia de ARN maduro no traducible.

Incremento de la expresión de secuencias recombinantes en eucariotas.

Estado de la técnica anterior

Los ribozimas son dominios de ARN capaces de catalizar autónomamente diferentes reacciones bioquímicas de forma similar a como lo hacen las proteínas. Entre los ribozimas descritos en la literatura se pueden destacar la RNAsa P, los intrones del grupo I y II, el "espliceosoma" o incluso el propio ribosoma, así como toda una familia de pequeños ARNs (<100 nt) que catalizan su propio autocorte de forma eficiente en un punto específico de su secuencia, actividad bioquímica que no existe en el mundo proteico en ausencia de componentes de ARN. Estos pequeños ribozimas de autocorte fueron inicialmente descubiertos hace casi 25 años en patógenos de plantas (ribozimas tipo cabeza de martillo o "hammerhead" y tipo horquilla o "hairpin", en viroides y satélites de virus de plantas) así como en el satélite de un virus humano (ribozima de tipo hepatitis delta o "HDV-like").

Desde entonces, dichos ribozimas han venido considerándose como simples curiosidades restringidas a este grupo de patógenos. Sin embargo, el ribozima de cabeza de martillo fue descrito posteriormente en el ADN repetitivo de varios organismos eucariotas no relacionados como salmandras (Epstein y Gall, 1987. Cell, 48: 535-543), tremátodos (Ferbeyre et al., 1998. Mol Cell Biol, 18: 3880-3888) y grillos (Rojas et al., 2000. NAR 28: 4037-4043) y, más recientemente, en la planta A. thaliana (Przybilski et al., 2005. Plant Cell, 17: 1877-85) y en las regiones 3' no codificantes de genes Clec2 de roedores (Martick et al., 2008. Nature, 454: 899-902). Por otro lado, el grupo de Luptak y Szostak describió en 2006 la presencia conservada de un ribozima funcional de tipo hepatitis-delta en un intrón de un gen humano (Salehi-Ashtiani et al., 2006. Science, 313: 1788-1792) cuya posible función sigue hasta la fecha sin estar caracterizada. En Noviembre del pasado 2009 (Webb et al., 2009. Science, 326: 953), el grupo de Luptak ha descrito una sorprendente ubicuidad del ribozima tipo hepatitis-delta en genomas de una amplia variedad de organismos, que van desde bacterias a invertebrados y vertebrados inferiores. Destaca especialmente la aparición habitual de las mismas en regiones intrónicas de multitud de genes.

El incremento de la expresión de secuencias nucleotídicas de interés, fundamentalmente secuencias que codifican para proteínas, es un problema que se intenta resolver con diferentes técnicas recombinantes, fundamentalmente con el uso de secuencias promotoras de la expresión, como por ejemplo, el promotor 35S sólo o en varias copias en tándem, que permite una expresión ectópica constitutiva de la secuencia de interés en el organismo huésped. En este sentido, es conocido un sistema para incrementar la expresión genética en plantas que incluye una secuencia que codifica para un ribozima, situado en el extremo terminal 3' del ADN complementario de dicha construcción viral recombinante (Lindbo, 2007. BMC Biotechnology, 7: 52), sin embargo la secuencia de autocorte ribozimático (Rz) que forma parte de la construcción genética no está implicada en el aumento de la expresión del gen correspondiente. Otro ejemplo de construcciones moleculares y métodos para el control de la expresión implican el uso de ribozimas e intrones (WO 2006073727 A2), pero sin embargo, ello no supone el incremento de la expresión de la secuencia de ADN de interés.

Por tanto, hasta el momento se siguen buscando sistemas capaces de incrementar la expresión de secuencias nucleotídicas de interés y no se han relacionado ribozimas e intrones con dicho propósito, por tanto, existe un gran interés en generar un sistema genético capaz de incrementar la expresión de dichas secuencias de forma que se consigan incrementos de alrededor de un orden de magnitud, lo que podría implicar una ventaja de enorme interés en la industria biotecnológica.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere al uso de un polinucleótido para el incremento, en al menos una célula eucariótica, de la expresión de una secuencia nucleotídica aislada en la que está insertado dicho polinucleótido. El polinucleótido comprende una secuencia de autocorte ribozimático insertada en la secuencia de un intrón nuclear no autocatalítico, donde dicha secuencia intrónica debe cumplir unos requisitos mínimos para su correcta escisión durante el madurado del ARN mensajero. Dichos requisitos se especifican más adelante. Asimismo, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de autocorte ribozimático tipo HHR (Hammerhead Ribozyme) procedente de un mamífero insertada en un intrón nuclear no autocatalítico procedente de una planta, donde la secuencia nucleotídica del intrón cumple con dichos requisitos mínimos y dicho polinucleótido está insertado en una secuencia nucleotídica aislada, así como el uso de dicho polinucleótido para incrementar la expresión de la secuencia nucleotídica aislada en la que se inserta. La secuencia nucleotídica aislada que aumenta su expresión como consecuencia de la inserción de dicho polinucleótido, puede codificar para una proteína o para una secuencia de ARN maduro no traducible.

Por tanto, la presente invención provee un polinucleótido para incrementar la expresión de cualquier secuencia nucleotídica sin afectar a la secuencia resultante de dicha expresión y procesamiento o maduración del ARN resultante. Así, el empleo del polinucleótido descrito en la presente invención tiene especial utilidad en la transformación de construcciones recombinantes de todo organismo eucariótico que disponga de mecanismo de silenciamiento génico mediado por ARN como por ejemplo, pero sin limitarse, en plantas y animales.

La presente invención supone un avance tecnológico relevante para el estado de la técnica al suponer una herramienta que permite obtener mayor cantidad de producto resultante de la expresión de una secuencia nucleotídica aislada de interés, respecto de las herramientas conocidas hasta el momento. El uso del polinucleótido descrito en la presente invención tiene aplicación, por ejemplo, en la obtención de compuestos de valor terapéutico por medio de la técnica conocida como "molecular pharming" o "biopharming", es decir, el uso de células u organismos para la producción de compuestos de interés, o, por otra parte, para aumentar la cantidad de ARN de interferencia empleado en terapias de silenciamiento génico.

Por tanto, la presente invención resuelve eficazmente el problema técnico que plantea la necesidad de sobre-expresar secuencias nucleotídicas de interés ya que, tal como se muestra en el apartado de ejemplos, se consigue mejorar en alrededor de un orden de magnitud la expresión de la secuencia que codifica para la proteína GFP controlada por el promotor constitutivo CMV 35S. Este resultado supone la mejora de la eficacia en la expresión genética respecto de una construcción recombinante que comprende el promotor CMV 35S, que ha sido empleado y se sigue empleando en la actualidad como un procedimiento eficiente para sobre-expresar secuencias nucleotídicas de interés.

Además, en la presente invención se utilizan análisis bioinformáticos, estructurales, bioquímicos y filogenéticos para mostrar la presencia de ribozimas HHRs ultraconservados en genomas de Amniotas (reptiles, pájaros y mamíferos), similares a los descritos previamente en anfibios y parásitos platelmintos. Concretamente, un primer motivo HHR conservado desde aves hasta humanos se localizó en un intrón del gen RECK, que codifica para un factor clave en angiogenesis y supresión de tumores. La caracterización in vitro de esta HHR confirmó su elevada actividad ribozimática, y un análisis de los ESTs de RECK mostraron eventos de fusión in vivo entre los fragmentos de autocorte del intrón y fragmentos de los ARNs U5 y U6 del complejo "espliceosomal". De manera similar, se encontraron HHRs en un gen para un antígeno tumoral de linfoma cutáneo de células T conservadas en mamíferos desde ornitorrinco hasta humanos. Finalmente, un tercer HHR fue hallado en el primer intrón del gen que codifica para la distrobrevina beta en lagarto y aves, pero ausente en sus ortólogos humanos. De manera conjunta estos resultados apuntan a la existencia de un mecanismo conservado en los Amniotas que actuaría durante la biogénesis del ARN mensajero implicando a ribozimas como por ejemplo los de tipo HHRs.

1. Uso de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica, que codifica para al menos una secuencia de autocorte ribozimático, donde dicha secuencia de autocorte ribozimático:

para el incremento de la expresión de una secuencia nucleotídica aislada, en al menos una célula eucariótica, respecto de un control, donde además, dicho polinucleótido está insertado en cualquier posición de dicha secuencia nucleotídica que incrementa su expresión.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el polinucleótido comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una sola secuencia de autocorte ribozimático.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la secuencia de autocorte ribozimático procede de un animal amniota.

4. Uso según la reivindicación 3, donde la secuencia de autocorte ribozimático procede de un mamífero.

5. Uso según la reivindicación 4, donde la secuencia de autocorte ribozimático que procede de un mamífero es de tipo "cabeza de martillo" (HHR).

6. Uso según la reivindicación 5, donde la secuencia de autocorte ribozimático tipo HHR es SEQ ID NO: 1 o cualquiera de sus homólogos en cualquier animal amniota.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el intrón nuclear no autocatalítico procede de un organismo vegetal.

8. Uso según la reivindicación 7, donde el organismo vegetal es una planta.

9. Uso según la reivindicación 8, donde la planta es del género Solanum.

10. Uso según la reivindicación 9, donde la planta es de la especie Solanum tuberosum.

11. Uso según la reivindicación 10, donde el intrón nuclear no autocatalítico es un intrón del gen ST-LS1 o de cualquiera de los homólogos de dicho gen en plantas.

12. Uso según la reivindicación 11, donde el intrón es SEQ ID NO: 2 o cualquiera de sus homólogos en plantas.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde además, la secuencia nucleotídica que incrementa su expresión está unida funcionalmente en su extremo 5' a una secuencia reguladora de la expresión génica.

14. Uso según la reivindicación 13, donde dicha secuencia reguladora de la expresión génica es un promotor constitutivo.

15. Uso según la reivindicación 14, donde el promotor constitutivo es el promotor 35S del virus del mosaico de plantas.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la célula eucariótica es de un organismo vegetal.

17. Uso según la reivindicación 16, donde el organismo vegetal es una planta.

18. Uso según la reivindicación 17, donde la planta es de la familia Solanaceae.

19. Uso según la reivindicación 18, donde la planta es del género Nicotiana.

20. Uso según la reivindicación 19, donde la planta es de la especie Nicotiana benthamiana.

21. Uso de un vector de expresión que comprende el polinucleótido y la secuencia nucleotídica en la que está insertado, descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para el incremento de la expresión de dicha secuencia nucleotídica en al menos una célula eucariótica, respecto de un control.

22. Uso de una célula eucariótica aislada modificada genéticamente que comprende:

para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, respecto de un control.

23. Uso de una planta modificada genéticamente que comprende:

para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, respecto de un control.

24. Uso de germoplasma de la planta modificada genéticamente descrita en la reivindicación 23, para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, respecto de un control.

25. Uso de polen que comprende la célula eucariótica modificada genéticamente según se describe en la reivindicación 22, para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, respecto de un control.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde la secuencia nucleotídica aislada en la que está insertado dicho polinucleótido, codifica para al menos una proteína.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde la secuencia nucleotídica aislada en la que está insertado dicho polinucleótido, codifica para al menos un ARN maduro no traducible.

28. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica, que codifica para al menos una secuencia de autocorte ribozimático tipo HHR procedente de un mamífero, donde dicha secuencia de autocorte ribozimático:

donde además, dicho polinucleótido está insertado en cualquier posición de una secuencia nucleotídica aislada.

29. Polinucleótido según la reivindicación 28, donde la secuencia aislada de autocorte ribozimático tipo HHR procede de un humano y el intrón nuclear no autocatalítico procede de un gen de una planta del género Solanum.

30. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29, donde la secuencia de autocorte ribozimático tipo HHR es SEQ ID NO: 1 o cualquiera de sus homólogos en cualquier animal mamífero.

31. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, donde el intrón nuclear no autocatalítico es un intrón del gen ST-LS1 o de cualquiera de los homólogos de dicho gen en plantas.

32. Polinucleótido según la reivindicación 31, donde dicho intrón nuclear no autocatalítico del gen ST-LS1 es la secuencia SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia homologa de una planta.

33. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, donde dicho polinucleótido tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.

34. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33.

35. Célula eucariótica aislada modificada genéticamente que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33 de forma estable o transitoria, o el vector según la reivindicación 34.

36. Planta modificada genéticamente que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33 de forma estable o transitoria; o el vector según la reivindicación 34; o la célula eucariótica modificada genéticamente según la reivindicación 35.

37.Germoplasma de la planta según la reivindicación 36.

38. Polen que comprende la célula eucariótica según la reivindicación 35.

39. Uso del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33; del vector según la reivindicación 34; de la célula eucariótica según la reivindicación 35; de la planta según la reivindicación 36; del germoplasma según la reivindicación 37; o del polen según la reivindicación 38, para el incremento de la expresión de la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, respecto de un control.

40. Uso según la reivindicación 39, donde la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido codifica para al menos una proteína.

41. Uso según la reivindicación 39, donde la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido codifica para al menos un ARN maduro no traducible.

42. Método para el incremento de la expresión de una secuencia nucleotídica aislada, en al menos una célula eucariótica, respecto de un control, que comprende:

43. Método para el incremento de la expresión de una secuencia nucleotídica aislada, en al menos una planta, respecto de un control, que comprende:

44. Método según cualquiera de las reivindicaciones 42 ó 43, donde la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, codifica para al menos una proteína.

45. Método según cualquiera de las reivindicaciones 42 ó 43, donde la secuencia nucleotídica en la que está insertado dicho polinucleótido, codifica para al menos un ARN maduro no traducible.