HISTONAS BIS-MET.

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que consiste en dos residuos de metionina como primero y segundo aminoácidos en el extremo N unidos a través de un enlace peptídico a una histona eucariota madura. La presente invención se refiere además a un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico, un huésped transformado con dicho vector, a polipéptidos codificados por la molécula de ácido nucleico y a composiciones farmacéuticas y diagnósticas. La presente invención también se refiere al uso de la molécula de ácido nucleico, vectores, huéspedes y el polipéptido de la invención para la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedades. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de analizar la presencia de la molécula de ácido nucleico o del polipéptido en una muestra y a un kit. A lo largo de la presente memoria descriptiva se citan diversos documentos. El contenido de la divulgación de dichos documentos, incluidos los manuales del fabricante, se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia. Actualmente existe un enorme interés económico en la producción de niveles elevados de proteínas recombinantes, como las histonas. La producción de grandes cantidades de proteínas recombinantes no solo es de interés para la finalidad de proporcionar una cantidad suficiente de proteína para estudiar sus propiedades y funciones, sino también para el suministro de cantidades grandes de proteína para uso terapéutico. Para el éxito de la producción de niveles elevados y de purificación de proteínas recombinantes se tiene que tener en cuenta una gran cantidad de parámetros. Los parámetros importantes incluyen las condiciones de expresión, la regulación de la traducción y la estabilidad del ARNm, las dianas proteicas y su degradación (Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512). Un abordaje con el fin de mejorar la producción, detección y purificación de proteínas recombinantes es el uso de una amplia variedad de parejas de fusión (Makrides, S., Microbiblogical Reviews, 1996: 512). Se han desarrollado técnicas elaboradas para incluir marcadores de afinidad para la purificación y detección de proteínas recombinantes. Dichos marcadores de afinidad combinan las ventajosas propiedades de permitir una purificación más eficaz al tiempo que permiten también una fácil detección de la proteína recombinante usado el marcador. No obstante, en muchos casos, la adición de un marcador de afinidad bastante grande puede suponer una ventaja debido a efectos no deseados sobre la traducción, plegamiento y actividad de la proteína. Especialmente para usar en aplicaciones terapéuticas suele ser necesaria la eliminación posterior del marcador de afinidad, de modo que se alivian algunos de los efectos positivos (p. ej., detección fácil) que el marcador de afinidad confiere a la proteína (Gellissen, G. "Production of Recombinant Proteins", 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co: KgaA, Weinheim). La incorporación de un residuo de metionina en el extremo N de cada polipéptido naciente constituye parte de la señal de iniciación de la traducción universal, usado por procariotas así como por eucariotas. En E. coli, la eliminación de estos residuos de metionina en el extreme N se consigue mediante la enzima citoplasmática metionina aminopeptidasa (map) (Hirel y col., Biochemistry, 1989, 86:8247). Se ha demostrado que el procesamiento eficiente del residuo de metionina en el extremo N de las proteínas eucariotas recombinantes producidas en procariotas, por ejemplo en E. coli, depende del aminoácido adyacente a la metionina. Aunque existen datos contradictorios para algunos de los aminoácidos, parece estar aceptado que la probabilidad de escisión es mayor para los residuos de aminoácidos pequeños y sin carga Ala, Gly, Pro, Ser, Val, Cys y Thr. Parece que cadenas laterales más grandes no son ventajosas para el procesamiento de la metionina (Hirel y col., Biochemistry, 1989, 86:8247; Frottin y col. Mol. & Cell. Proteomics, 2006, 12:2336; Gellissen, G. "Production of Recombinant Proteins", 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co., KgaA, Weinheim). Se piensa que el procesamiento de la metionina en N-terminal desempeña papeles importantes para la estabilidad de la proteína (Giglione y col. EMBO J., 2003,1:13), y también para la correcta función de la proteína, como se muestra para, por ejemplo, MEF-2C, hemoglobina humana, interleucina-1, homólogos de la ARNasa A o ribonucleasa de rana (Meierhans y Allemann, J. Biol. Chem., 1998, 273:26052; Adachi, K. y col., Protein Expr. Purif., 2000, 20:37; Endo, S. y col., Biochemistry, 2001,40:914; Boix, E. y col., J. Mol. Biol., 1996,257:992; Liao, Y.D. y col., Nucleic Acids Res., 2003, 31:5247; Varshavsky, A., Proc., Natl. Acad. Sci., 1996, 93: 12142). Una teoría adicional en cuanto a la razón por la cual la naturaleza ha conservado un sistema enzimático tan especializado para eliminar el residuo de metionina es para reciclar el conjunto de metionina celular para economizar este aminoácido esencial (Hirel y col., Biochemistry, 1989, 86:8247). El documento EP1254166 describe la producción recombinante de proteínas histonas en E. coli. Dicha producción recombinante de proteínas humanas se considera ventajosa para aplicaciones terapéuticas, así como más eficaz y rentable en comparación con preparaciones de timo humano o de ternero. Además, la producción recombinante de proteínas permite un mejor control de calidad durante el procedimiento de producción. Pyo y col. (Pyo, S.H y col., Protein Expr. Purif., 2001, 1:38) describe la producción de la histona recombinante H1.5 2   en E. coli usando las propiedades fuertemente básicas de la histona para desarrollar un procedimiento eficaz para la purificación a gran escala de proteínas recombinantes. Aunque en la estado de la técnica se ha mostrado una producción de niveles elevados de proteínas recombinantes, no obstante existe una sustancial necesidad de encontrar procedimientos adecuados de detectar la proteína recombinante resultante. Como se ha tratado anteriormente, el uso de marcadores de afinidad, tal como marcadores de his, está muy extendido en la técnica, pero puede suponer un problema para la producción de proteínas para uso terapéutico. Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar mejores polipéptidos eucariotas recombinantes que, por ejemplo, permitan una simplificación de la producción y la detección. La solución a este problema técnico se obtiene mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. De acuerdo con esto, la presente invención se refiere en una primera realización a una molécula de ácido nucleico que (a) codifica un polipéptido que consiste en (aa) dos residuos de metionina como el primero y el segundo residuos de aminoácidos en el extremo N unidos mediante un enlace peptídico a (ab) una histona eucariota madura; (b) codifica un polipéptido que consiste en (ba) dos residuos de metionina como el primero y el segundo residuos de aminoácidos en el extremo N unidos mediante un enlace peptídico a (bb) un polipéptido eucariota maduro que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80 % con la histona eucariota madura de (a) y que esencialmente conserva su actividad biológica; o (c) hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de (a) o (b), en el que dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene al menos los dos residuos de metionina en el extremo N y que conserva esencialmente la actividad biológica del polipéptido de (a) o (b). Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención incluyen ADN, tal como ADNC o ADN genómico, ARN (p. ej., ARNm), también en forma sintética o semisintética, otros derivados sintéticos o semisintéticos de ADN o ARN (p. ej., PNA o fosforotioatos) y polímeros mixtos, hebras tanto sentido como antisentido. Pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es ADN, incluido ADN genómico. Para los fines de la presente invención, un ácido nucleico peptídico (PNA) es un tipo de poliamida de ADN análogo y las unidades monoméricas para los derivados de adenina, guanina, timina y citosina están disponibles comercialmente (Perceptive Biosystems). Ciertos componentes del ADN, como el fósforo, óxidos de fósforo o derivados de desoxirribosa, no están presentes en los PNA. Como han divulgado Nielsen y col., Science 254:1497 (1991) y Egholm y col., Nature 365:666 (1993), los PNA se unen específica y fuertemente a las hebras de ADN complementarias y no son degradados por las nucleasas. De hecho,... [Seguir leyendo]

(aa) dos residuos de metionina como el primero y el segundo residuos de aminoácidos en el extremo N unidos mediante un enlace peptídico a (ab) una histona eucariota madura; b) codifica un polipéptido que consiste en (ba) dos residuos de metionina como el primero y el segundo residuos de aminoácidos en el extremo N unidos mediante un enlace peptídico a (bb) un polipéptido eucariota maduro que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la histona eucariota madura de (a) y que esencialmente conserva su actividad biológica; o c) hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de (a) o (b), en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene al menos dos residuos de metionina en el extremo N y conserva esencialmente la actividad biológica del polipéptido de (a) o (b). 2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la histona se selecciona del grupo que consiste en las histonas H1.0, H1.1, H1.2, H1.3, H1.4, H1.5 y H1t. 3. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2. 4. Un oligonucleótido o polinucleótido antisentido de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el oligonucleótido o polinucleótido comprende los nucleótidos complementarios con los tripletes de nucleótidos que codifican los dos residuos de metionina en el extremo N de (aa), (ba) o (c) y tiene una longitud mínima de 10 nucleótidos. 5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2. 6. Un huésped transformado con el vector de la reivindicación 5, en el que el huésped no es un ser humano y no es un embrión humano. 7. El huésped de la reivindicación 6, que es una bacteria, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula fúngica, una célula de mamífero o una célula vegetal. 8. Un procedimiento de producir un polipéptido que comprende cultivar el huésped de la reivindicación 6 o 7 en condiciones adecuadas y aislar el polipéptido producido. 9. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o producido por el procedimiento de la reivindicación 8. 10. Una composición que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 o el vector de la reivindicación 5 o el huésped de la reivindicación 6 o 7 o el polipéptido de la reivindicación 9. 11. La composición de la reivindicación 10, que además comprende la histona eucariota madura. 12. La composición de la reivindicación 10 u 11, que es una composición farmacéutica que opcionalmente comprende además un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. 13. La composición de la reivindicación 10 u 11, que es una composición diagnóstica. 14. El uso de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o el vector de la reivindicación 5 o el huésped de la reivindicación 6 o 7 o el polipéptido de la reivindicación 9, para la preparación de una composición con fines terapéuticos y/o diagnósticos. 15. El uso de la reivindicación 14, en el que la finalidad terapéutica es el tratamiento de cáncer, trombocitopenia, infecciones, tales como infecciones bacterianas, víricas o fúngicas, enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus eritematoso sistémico (LES) o artritis reumatoide, colitis ulcerosa o enfermedades con fibrillas de tipo amiloide, 38   tales como enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP), leishmaniasis, miopatía o trastornos cardiovasculares relacionados con eventos trombóticos. 16. Un anticuerpo o aptámero o fago que reconoce de forma específica la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 o el polipéptido de la reivindicación 9, pero no se une a la correspondiente histona eucariota madura o al correspondiente polipéptido eucariota que no tiene dos residuos de metionina en el extremo N. 17. Una composición diagnóstica que comprende el anticuerpo, aptámero y/o fago de la reivindicación 16. 18. Un procedimiento para analizar la presencia de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 o el polipéptido de la reivindicación 9, que comprende someter a ensayo una muestra obtenida de un sujeto para detectar la presencia de dicha molécula de ácido nucleico o polipéptido. 19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicha muestra es sangre, suero, plasma, saliva, orina, tejido mucoso, mucus. 20. Kit que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 5 o el huésped de la reivindicación 6 o 7 o el polipéptido de la reivindicación 9 o el anticuerpo, aptámero y/o fago de la reivindicación 16 en uno o más contenedores. 39     41   42