Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso.

Derivado de hemoglobina compatible con plasma humano y animal,

caracterizado porque la hemoglobina estáreticulada covalentemente mediante un reticulante bifuncional para proteínas seleccionado de diepóxido de butano,divinilsulfona, un diisocianato, un éster di-N-hidroxisuccinimidílico, un diimidoéster o un dialdehído o glicolaldehídoutilizando un exceso molar de 3 a 60 veces referido a hemoglobina monomérica y a continuación un poli(óxido dealquileno) con un peso molecular (masa molar) entre 200 y 5.000 g/mol que es un producto de unión de poli(óxido dealquileno) con una molécula que enmascara un grupo hidroxi terminal del poli(óxido de alquileno) está unidocovalentemente a la hemoglobina.

Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli (óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso La invención se refiere a hemoglobinas de mamífero covalentemente reticuladas con reticulantes bifuncionales seleccionados de diepóxido de butano, divinilsulfona, un diisocianato, un éster di-N-hidroxisuccinimidílico, un diimidoéster o un dialdehído o glicolaldehído utilizando un exceso molar de 3 a 60 veces referido a hemoglobina monomérica a las que está unida covalentemente un poli (óxido de alquileno) cuyo grupo hidroxi terminal está enmascarado con una molécula enmascaradora y cuyo peso molecular (masa molar) asciende a entre 200 y 5.000 g/mol. Tales hemoglobinas son sorprendentemente compatibles con proteínas de plasmas humanos y animales en todas las condiciones posibles en el aparato vascular del cuerpo. La invención se refiere además a la preparación de estas hemoglobinas reticuladas y unidas con poli (óxidos de alquileno) , así como a su uso como portadores de oxígeno intravasales artificiales en el organismo humano o animal, en órganos individuales o para fines biomédicos. Los portadores de oxígeno artificiales son sustancias que se unen reversiblemente y liberan oxígeno de una forma adecuada para un organismo, así como sustituyen o apoyan la función de transporte de oxígeno de la sangre. Se han desarrollado preparaciones farmacéuticas de disoluciones o suspensiones de portadores de oxígeno artificiales para administrarse parenteralmente en el aparato vascular, especialmente intravenosamente, a seres humanos o animales para el tratamiento de estados de deficiencia de oxígeno agudos y crónicos, así como pérdidas de sangre agudas. Además, también pueden utilizarse para la perfusión de trasplantes de órganos o como adición de cultivos celulares para mejorar aquí el aporte de oxígeno.

Los portadores de oxígeno artificiales de hemoglobinas se han desarrollado en todo el mundo basándose en diferentes conceptos (estado de la técnica: Rudolph A. S. y col. (Hrsg.) : Red Blood Cell Substitutes: Basic Principles and Clinical Applications, Marcel Dekker, Nueva York, entre otros 1998; Tsuchida E. (Hrsg.) : Blood Substitutes:Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Ámsterdam, 1998; Chang T. M. S. (Autor o Hrsg.) : Blood Substitutes: Principles, Methods, Products and Clinical Trials, volumen 1 y volumen 2, Karger Landes, Basilea, entre otros, 1997 y 1998) . Todos los conceptos tienen en común la preparación de portadores artificiales con propiedades de unión a oxígeno adecuadas que pueden garantizar el transporte de oxígeno in vivo. Estas propiedades dependen del campo de aplicación deseado del portador y la mayoría de las veces están orientadas a la sangre humana. La hemoglobina extracelularmente disuelta nativa no es adecuada como portador de oxígeno ya que se descompone intravasalmente en sus subunidades y ésta es rápidamente secretada por el riñón debido a su bajo peso molecular. Por tanto, se intenta prolongar el tiempo de permanencia intravasal de hemoglobinas naturales o preparadas por tecnología genética en el organismo. Las prolongaciones del tiempo de permanencia intravasal resultan por

- Microencapsulación de disoluciones de hemoglobina en liposomas, los llamados hemosomas (Ogata Y. (1994) : “Characteristics of Neo Red Cells, Their Function and Safety: In Vivo Studies”, Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnologies 22: 875 - 881) ;

-enlaces intramoleculares covalentes, es decir, una estabilización de la estructura cuaternaria de las hemoglobinas por reticulantes bifuncionales (Farmer M. C. y col. (1995) : “Preclinical Data and Clinical Trials with Diaspirin Cross-linked Hemoglobin”, - Tsuchida E. (Ed.) : Artificial Red Cells, John Wiley 1995: 177 - 185; Bakker

J. C. y col. (1988) : “Properties of Hemoglobin Interdimerically Cross-linked with NFPLP”, Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnologies 16: 635 - 636) o por obtención por tecnología genética (Looker D. y col. (1992) : “A Human Recombinant Haemoglobin Designed for Use as a Blood Substitute”, Nature 356: 258 260) ;

- unión covalente de macromoléculas con la hemoglobina, por ejemplo, polisacáridos, dextranos, hidroxietilalmidón, inulina o macromoléculas solubles en agua artificiales como polietilenglicoles (Xue H., Wong

J. T. F. (1994) : “Preparation of Conjugated Hemoglobins”, - Abelson J. N., Simon M. I. (Ed.) : Methods of

Enzymology, volumen 231 B, Academic Press 1994: 308 - 322; Tam S. C. y col. (1978) : “Blood Replacement in Dogs by Dextran-Hemoglobin”, Canadian Journal of Biochemistr y 56: 981 - 984; memorias de patente DE-A 30 26 398 (1981) : “Modifiziertes Hämoglobin enthaltender Blutersatz”; documento EP-A 0 069 026 (1982) : “Oxygen Carrier”; documento EP-A 0 206 448 (1986) : “Hemoglobin Combined with a Poly (Alkylene Oxide) ”; documento US 5.234.903 (1993) : “Chemically Modified Hemoglobin as an Effective, Stable, Non-immunogenic Red Blood Cell Substitute” y documento US 5.312.808 (1994) : “Fractionation of Polyalkylene Oxide-Conjugated Hemoglobin Solutions”) ;

- reticulación intermolecular (polimerización) de hemoglobinas con reticulantes bifuncionales (Gould S. A. y col. (1998) : “The Clinical Development of Human Polymerized Hemoglobin”, - Chang T. M. S. (Ed.) : Blood Substitutes: Principles, Methods, Products and Clinical Trials, volumen 2, Karger Landel Systems 1998: 12 - 28;

Pearce L. B., Gawr y l M. S. (1998) : “Overview of Preclinical and Clinical Efficacy of Biopure's HBOCs”, - Chang

T. M. S. (Ed.) : Blood Substitutes: Principles, Methods, Products and Clinical Trials, volumen 2, Karger Landel Systems 1998: 82 - 98; Bakker J. C. y col. (1992) : “Preparation and Characterization of Crosslinked and Polymerized Hemoglobin Solutions”, Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnologies 20: 233 241) .

Los últimos portadores de oxígeno artificiales mencionados basados en hemoglobinas reticuladas poseen una serie de ventajas en comparación con los otros: las hemoglobinas reticuladas suficientemente grandes (polímeros de hemoglobina) disponen de una presión osmótica coloidal tan baja que no sólo pueden utilizarse como sustituto del volumen de sangre que transporta oxígeno para sustituir la sangre que falta, debido a su tan baja presión osmótica coloidal inherente luego combinada con un expansor de plasma, sino que especialmente también pueden añadirse a la sangre como aditivo de la sangre transportador de oxígeno (Barnikol W. K. R. y col. (1996) : “Hyperpolymere Hämoglobine als künstliche Sauerstoffträger. Ein innovativer Ansatz der medizinischen Entwicklung”, Therapiewoche 46: 811 - 815) . Las áreas de indicación para aditivos de transporte de oxígeno de este tipo son el tratamiento de muchos estados de deficiencia de oxígeno crónicos como, por ejemplo, anemias, accidentes cerebrovasculares o infartos cardíacos. El tratamiento con un aditivo tal siempre es posible incluso sin una pérdida de sangre; por el contrario, todos los otros sustitutos de volumen que transportan oxígeno mencionados son exclusivamente adecuados para el tratamiento de estados de deficiencia de oxígeno agudos después de pérdidas de sangre. Las hemoglobinas reticuladas con alto grado de reticulación poseen además la ventaja de un tiempo de permanencia intravasal especialmente prolongado. Además, después de su administración no debe contarse con elevaciones de la tensión arterial ya que no abandona los vasos sanguíneos debido a su tamaño y, por tanto, no pueden actuar de constrictores de la musculatura vascular (véase más adelante) . De manera equivalente además de la eficacia, en el centro de todos los desarrollos siempre está también la evaluación y dado el caso mejora de la inocuidad de los portadores de oxígeno artificiales (Fratantoni J. C. (1991) : “Points to Consider in the Safety Evaluation of Hemoglobin-based Oxygen Carriers”, Transfusion 31: 369 - 371) . Por ejemplo, se observa un aumento de la tensión arterial y una elevación de la resistencia vascular periférica total en ratas anestesiadas después de la administración intravasal de hemoglobinas intramolecularmente reticuladas (Sharma A. C. y col. (1993) : “Role of NO Mechanism in Cardiovascular Effects of Diaspirin Cross-linked Hemoglobin in Anesthetized Rats”, American Journal of Physiology 269: H 1379 -H 1388) . Esta acción vasoconstrictora de portadores de oxígeno artificiales molecularmente dispersos puede tanto basarse en una hiperoxigenación... [Seguir leyendo]

1. Derivado de hemoglobina compatible con plasma humano y animal, caracterizado porque la hemoglobina está reticulada covalentemente mediante un reticulante bifuncional para proteínas seleccionado de diepóxido de butano, divinilsulfona, un diisocianato, un éster di-N-hidroxisuccinimidílico, un diimidoéster o un dialdehído o glicolaldehído utilizando un exceso molar de 3 a 60 veces referido a hemoglobina monomérica y a continuación un poli (óxido de alquileno) con un peso molecular (masa molar) entre 200 y 5.000 g/mol que es un producto de unión de poli (óxido de alquileno) con una molécula que enmascara un grupo hidroxi terminal del poli (óxido de alquileno) está unido covalentemente a la hemoglobina.

2. Derivado de hemoglobina según la reivindicación 1, caracterizado porque el diisocianato está seleccionado de hexametilendiisocianato, ciclohexildiisocianato, ácido 2, 5-bisisocianatobencenosulfónico.

3. Derivado de hemoglobina según la reivindicación 1, caracterizado porque el dialdehído está seleccionado de glioxal o glutardialdehído.

4. Derivado de hemoglobina compatible con plasma según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la hemoglobina es de origen humano, de res o de cerdo.

5. Derivado de hemoglobina compatible con plasma según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque un derivado de poli (óxido de alquileno) seleccionado de poli (óxido de etileno) , poli (óxido de propileno) o copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno está unido a la hemoglobina.

6. Derivado de hemoglobina según la reivindicación 5, caracterizado porque el número de poli (óxidos de alquileno) unidos asciende a entre 1 y 40 moléculas de poli (óxido de alquileno) por molécula del monómero de hemoglobina.

7. Derivado de hemoglobina según la reivindicación 6, caracterizado porque la hemoglobina está reticulada mediante glutardialdehído.

8. Derivado de hemoglobina según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el poli (óxido de alquileno) unido covalentemente posee una masa molar entre 500 y 2000 g/mol.

9. Procedimiento para la preparación de derivados de hemoglobina como portadores de oxígeno artificiales que son compatibles con plasma sanguíneo humano/animal, caracterizado porque la hemoglobina está reticulada covalentemente con un reticulante bifuncional para proteínas seleccionado de diepóxido de butano, divinilsulfona, un diisocianato, un éster di-N-hidroxisuccinimidílico, un diimidoéster o un dialdehído o glicolaldehído utilizando un exceso molar de 3 a 60 veces, referido a hemoglobina monomérica, y un poli (óxido de alquileno) con un peso molecular (masa molar) entre 200 y 5.000 g/mol que es un producto de unión del poli (óxido de alquileno) con una molécula que enmascara un grupo hidroxi terminal de poli (óxido de alquileno) está unido covalentemente a la hemoglobina reticulada.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se utilizan hemoglobinas de ser humano, res o cerdo.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque la hemoglobina se reticula en una solución electrolítica acuosa tanto con un exceso molar de 3 a 60 veces, referido a hemoglobina monomérica, de un reticulante bifuncional para proteínas como también se une covalentemente con un exceso molar de 1 a 40 veces, referido a hemoglobina monomérica, de un poli (óxido de alquileno) y a continuación se elimina el exceso de reactivos y se purifica el producto.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el diisocianato está seleccionado de hexametilendiisocianato, ciclohexildiisocianato y ácido 2, 5-bisisocianatobencenosulfónico.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9-12, caracterizado porque el dialdehído está seleccionado de glioxal, el glicolaldehído que reacciona análogamente o glutardialdehído.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el reticulante bifuncional para proteínas es glutardialdehído.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque como poli (óxido de alquileno) se utiliza un derivado de un poli (óxido de etileno) , poli (óxido de propileno) o copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno.

16. Uso de una hemoglobina reticulada compatible con plasma según una de las reivindicaciones 1 a 8 o preparada según una de las reivindicaciones 9 a 15 para la preparación de un agente para la aplicación intravasal o biomédica como portador de oxígeno artificial.

17. Uso según la reivindicación 16, caracterizado porque el agente se usa en forma de una preparación farmacéutica como sucedáneo de la sangre, o como una adición a la sangre o a una solución nutritiva, en el

organismo humano y animal, en órganos individuales o en aplicaciones biotécnicas.