Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y

b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :

Fotoproteína mtCiclina aislada y su uso La invención se refiere a la fotoproteína mtClitina, a sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, y a la actividad y uso de la fotoproteína mtClitina.

Fotoproteínas La bioluminiscencia se refiere al fenómeno de generación de luz por los organismos vivos. Es el resultado de reacciones bioquímicas en células, reacciones en las que la energía química se emite en forma de cuantos de luz (que también se denomina emisión fría por quimioluminiscencia) . La luz generada de este modo es monocromática, ya que se emite durante una transferencia de electrones discretos, pero se puede desplazar a regiones del espectro de mayor longitud de onda mediante pigmentos luminiscentes secundarios (por ejemplo, proteínas fluorescentes en medusas luminiscentes del género Aequora) .

La función biológica es múltiple: a una profundidad marina de entre 200 y 1000 m (región mesopelágica) , aproximadamente el 90 % de todos los organismos vivos brilla. Aquí, las señales luminiscentes se emplean para atraer a la pareja, como engaño y como cebo. Los gusanos brillantes y las luciérnagas también explotan las señales 15 de luz para atraer a la pareja. Por el contrario, el significado de la luminiscencia de las bacterias, hongos y algas monocelulares no está claro. Se supone que se usa para coordinar muchos individuos únicos de una gran población o constituye una clase de reloj biológico.

Un gran número de celentéreos son bioluminiscentes (Morin y col., 1974) . Estos organismos emiten luz azul o verde. La aecuorina, que deriva de Aequoria victoria y que, en 1962, fue la primera proteína productora de luz que se 20 identificó (Shimomura et al., 1969) , emitió, como proteína aislada, una luz azul y no una luz verde como se observó fenotípicamente en el caso de Aequoria victoria. Más tarde, se aisló la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequoria victoria, proteína que hace que la medusa aparezca fenotípicamente verde como resultado de la excitación mediante acuorina (Johnson y col., 1962; Hastings y col., 1969; Inouye y col., 1994) . Otras fotoproteínas que también se han identificado y descrito son clitina (Inouye y col., 1993) , mitrocomina (Fagan y col., 1993) y obelina (Illarionov y col., 1995) .

Tabla 1: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el nombre, el organismo del que se ha aislado la proteína y el número de identificación (Nº Reg.) de la entrada en la base de datos.

Tabla 2: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el organismo del que se ha aislado la proteína, el nombre de la fotoproteína y una selección de patentes o solicitudes.

Actualmente, la bioluminiscencia se usa en la tecnología de muchos modos, por ejemplo en forma de bioindicadores de contaminación o en bioquímica para la detección sensible de proteínas, para la determinación cuantitativa de compuestos específicos o como lo que se conoce como “indicador” en el estudio de la regulación génica en células.

Las fotoproteínas no solo difieren en sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, sino también en sus propiedades bioquímicas y físicas.

Se ha demostrado que las propiedades físicas y bioquímicas de las fotoproteínas se pueden modificar a través de la alteración de la secuencia de aminoácidos. En la literatura se describen ejemplos de fotoproteínas mutageneizadas (documentos se 6.495.355; US 5.541.309; US 5.093.240; Shimomura y col., 1986) .

Las fotoproteínas mencionadas anteriormente generan luz oxidando la coelentarazina (Haddock y col., 2001; Jones y col., 1999) .

Markeva SV y col., Biochemistr y , Volumen 41, Nº 7, 19 de febrero de 2002, páginas 2227-2236, divulgan la clonación, el análisis de la secuencia y la expresión de la proteína obelina del hidroide pelagial bioluminiscente Obelia geniculata. El documento WO 91/01305 describe proteínas bioluminiscentes y su uso como marcadores/indicadores, entre otras, las fotoproteínas acuorina y obelina (página 7, líneas 17-21) . El documento también describe la posibilidad de unión de las proteínas mencionadas anteriormente a un péptido señal para el transporte al interior de los orgánulos celulares, tales como, por ejemplo, la mitocondria o el retículo endoplásmico (página 8, líneas 9-26) .

Dunstan SL y col., Journal of Biological Chemistr y , Volumen 275, Nº 13, 31/3/2000, páginas 9403-9409, divulga la fotoproteína folasina de Pholas dactylus, que contiene un péptido señal natural con 20 aminoácidos para la secreción de la proteína (resumen, página 9407, columna de la derecha, líneas 14-16) .

Sistemas indicadores

El término gen indicador se refiere, en general, a genes cuyos productos génicos pueden detectarse fácilmente usando sencillos procedimientos bioquímicos o histoquímicos. Se puede distinguir entre al menos 2 tipos de genes indicadores.

1. Genes de resistencia. La expresión genes de resistencia se refiere a genes cuya expresión confiere, sobre una célula, resistencia a antibióticos u otras sustancias cuya presencia en el medio de crecimiento produce la muerte de la célula si el gen de resistencia no está.

2. Genes indicadores. En la manipulación genética, los productos de los genes indicadores se usan en forma de indicadores condensados o no condensados. Entre los genes indicadores más usados se incluyen los de la beta-galactosidasa (Alam y col., 1990) , fosfatasa alcalina (Yang y col., 1997; Cullen y col., 1992) , luciferasas y otras fotoproteínas (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne y col., 1984) .

La luminiscencia se refiere a la emisión de fotones en el intervalo del espectro visible, efectuándose mediante moléculas emisoras excitadas. En contraste con la fluorescencia, aquí, la energía no se suministra desde el exterior en forma de radiación de una longitud de onda más corta.

Se establece una distinción entre quimioluminiscencia y bioluminiscencia. Una reacción química que tiene como resultado una molécula excitada que brilla cuando los electrones excitados vuelven al estado basal se denomina quimioluminiscencia. Si esta reacción es catalizada por una enzima, el fenómeno se denomina bioluminiscencia. Las enzimas implicadas en la reacción se denominan, en general, luciferasas.

Clasificación de la especie Clytia gregaria Cnidaria • Leptomedusae • Campanulariidae • Clytia gregaria La especie Clytia gregaria pertenece a los cnidarios, específicamente a las medusas. El fenotipo bioluminiscente o fluorescente ya se describió en 1998 (Ward y col., 1998) .

Aislamiento del ADNc

Para Investigar la actividad bioluminiscente de la especie Clytia gregaria, se obtuvieron especimenes en el Mar Blanco (Estación Biológica de Kartesh, Rusia) y se almacenaron en nitrógeno líquido. Para establecer las bibliotecas de ADNc de Clytia gregaria, se aisló el poli (a) +ARN con la ayuda del procedimiento de aislamiento “Straight A” de Novagen (EE.UU.) .

Para preparar en ADNc se llevó a cabo una PCR-RT. Con este fin, se incubó 1 μg de ARN con la transcriptasa inversa (Superscribt Gold II) de acuerdo con el esquema siguiente:

PCR 1. 30 segundos 95 º C

2. 6 minutos 68 º C

3. 10 segundos 95 º C

4. 6 minutos 68 º C

17 ciclos de la etapa 4 después de la etapa 3

Para inactivar la polimerasa, los productos de reacción se incubaron durante 30 minutos con proteinasa K a 37 º C y el ADNc se precipitó con etanol. La expresión de la biblioteca de ADNc se llevó a cabo con la ayuda del “kit de construcción de bibliotecas de ADNc SMART” de Clontech (EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se clonó en el vector de expresión pTriplEx2 (Clontech; EE.UU.) . Los vectores de expresión se transformaron mediante electroporación en bacterias de la cepa E. coli XL1-Blue.

Las bacterias se sembraron en placas con medio nutritivo LB sólido y se incubaron... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y 5 b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :

2. Ícido nucleico según la reivindicación 1, que contiene un promotor funcional en 5' de la secuencia de codificación.

3. Vectores de ADN o de ARN recombinantes que contienen ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Organismos no humanos que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un péptido o polipéptido, que está codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la 10 reivindicación 1.

6. Un procedimiento para expresar los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 5 en bacterias, sistemas víricos, levaduras o células eucarióticas o en sistemas de expresión in vitro.

7. Un procedimiento para purificar/aislar un polipéptido de fotoproteína de acuerdo con la reivindicación 6.

8. El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 como gen marcador o gen indicador.

9. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como indicador o marcador.

10. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como proteína indicadora para buscar principios activos farmacológicos.

11. El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 como gen indicador para buscar principios activos farmacológicos.