Expresión de células de insecto de genes con marcos de lectura abiertos superpuestos, métodos y composiciones de éstos.

Un casete de ácido nucleico para expresar en una célula de insecto una pluralidad de polipéptidos codificados por ungen que comprende marcos de lectura abiertos (ORF) superpuestos,

comprendiendo el casete, en orden 5' a 3':

a) un primer promotor operativo en células de insecto;

b) una parte 5' de un primer ORF del gen;

c) un intrón que comprende un segundo promotor operativo en células de insecto; y

d) una parte 3' del primer ORF del gen, en el que la parte 3' del primer ORF se superpone con al menos un ORFadicional y en el que el primer promotor operativo en células de insecto está unido de manera operativa al primer ORF; elprimer ORF comprende un primer codón de inicio de la traducción; el segundo promotor operativo en células de insectoestá unido de manera operativa al menos al un ORF adicional y el al menos un ORF adicional comprende al menos uncodón de inicio de la traducción adicional y en el que al menos uno de a), b), c) y d) es heterólogo al menos a un otro dea), b), c) y d).

Expresión en células de insecto de genes con marcos de lectura abiertos superpuestos, métodos y composiciones de éstos.

REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la Solicitud de Patente Provisional US 60/839.761 presentada el 24 de agosto, 2006.

INTRODUCCIÓN

Se sabe que los genes que comprenden marcos de lectura superpuestos (ORF) existen en los genomas de los mamíferos. En algunos casos, dichos genes comprenden un intrón que tiene un promotor que soporta la transcripción de un ORF (Véanse, por ejemplo, Reisman, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5146-5150, 1998; Bennett, V.D., et al., J. Biol. Chem. 265: 2223-2230, 1990) . Sin embargo, no se ha indicado que ningún gen de insecto, bien natural o artificial, codifique múltiples ORF y comprenda un promotor en un intrón.

Los Parvoviridae comprenden una familia de virus animales con ADN monocatenario. La familia Parvoviridae está dividida en dos subfamilias: la Parvovirinae, que infectan vertebrados y la Densovirinae, que infecta insectos. La subfamilia Parvovirinae (cuyos miembros se refieren en la presente memoria como parvovirus) incluye el género Dependovirus, cuyos miembros son únicos en que, bajo la mayoría de las condiciones, estos virus requieren la coinfección con un virus auxiliar tal como adenovirus o virus del herpes para la infección productiva en cultivo celular. El género Dependovirus incluye virus adeno-asociados (AAV) , que normalmente infectan seres humanos y primates (por ejemplo, serotipos 1, 2, 3, 3A, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11) y virus relacionados que infectan otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adeno-asociados de bovino, canino, equino y ovino) . Los parvovirus y otros miembros de la familia Parvoviridae se describen en general en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The viruses and Their Replication, " Capítulo 69 en FIELDS VIROLOGY (3a Ed. 1996) y el artículo de revisión reciente por Choi et al., Curr Gene Ther., Jun; 5 (3) :299-310 (2005) .

El genoma de AAV es una molécula de ADN lineal, monocatenaria que tiene una longitud menor de aproximadamente 5.000 nucleótidos (nt) . Repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las únicas secuencias de nucleótidos codificadoras para las proteínas de replicación no estructurales (Rep) y las proteínas estructurales (VP) . Las ITR son auto-complementarias y están organizadas de manera que puede formarse una horquilla con forma de T de dúplex intramolecular energéticamente estable. Estas estructuras en horquilla funcionan como un origen para la replicación del ADN viral. Los genes Rep codifican las proteínas Rep, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. Rep78 y su variante de corte y empalme Rep68 se traducen a partir de ARNm que se transcriben a partir del promotor p5. Rep52 y su variante de corte y empalme Rep40 se traducen a partir de ARNm que se transcriben a partir del promotor p19. Los genes Cap codifican las proteínas VP, VP1, VP2 y VP3. Estas proteínas forman la cápside y se sintetizan a partir de dos ARNm sometidos a corte y empale que surgen de la transcripción del gen Cap a partir del promotor p40. Un mensaje se traduce en VP1, mientras que otro transcrito codifica VP2 y VP3. El codón de inicio natural para VP2 es un ACG, que se utiliza poco, que resulta en el escaneo del ribosoma a través del codón de inicio de VP3 (AUG) . Se cree que el uso alternativo de dos sitios aceptores de corte y empalme para el transcrito de VP1 y la utilización pobre del codón de inicio ACG para VP2 son responsables de las estequiometría de VP1, VP2 y VP3 en las células de mamífero infectadas con AAV y refleja la relación de proteínas en las cápsides, 1:1:10. Urabe, M. et al., Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943, 2002.

Se sabe que una ITR de un AAV funciona como un origen de replicación, es decir, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación y sirve como un sitio de reconocimiento para las proteínas de replicación que actúan en trans (por ejemplo, Rep78 o Rep68) que reconocen las secuencias palindrómicas y específicas internas al palíndromo. Una excepción a la simetría de la secuencia de ITR es la región "D" de la ITR. Es única (no tiene un complemento en una ITR) . El mellado del ADN monocatenario ocurre en la unión entre las regiones A y D. Es la región en la que se inicia la síntesis de nuevo ADN. La región D normalmente está localizada en un extremo del palíndromo y proporciona direccionalidad a la etapa de replicación del ácido nucleico. Un AAV que se replica en una célula de mamífero tiene típicamente dos secuencias ITR.

En las células de mamífero, las cuatro proteínas Rep de AAV están codificadas por múltiples transcritos a partir de un único marco de lectura. Los promotores en las posiciones map 5 y 19 regulan la transcripción del ORF de Rep. Rep78 y 68 se expresan a partir del promotor p5 y se diferencian entre sí por un corte y empalme 3'. Rep68 es una versión truncada en carboxi de Rep78, aunque Rep68 contiene 7 residuos únicos como resultado de un desplazamiento de marco que ocurre en el sitio aceptor de corte y empalme. Los transcritos de Rep52 y Rep40 se expresan por el promotor p19 y están en marco con los polipéptidos Rep mayores. Los polipéptidos Rep menores se diferencian entre sí de la misma manera que Rep78 y Rep68, es decir, por un evento de corte y empalme. Los dominios funcionales de Rep son: extremo amino-unión de ADN-mellado de ADN-ATPasa-Helicasa-señal de localización nuclear-dedo de cinc modificado-COOH. Las funciones de la unión a ADN y mellado de ADN están presentes sólo en las proteínas Rep transcritas a partir de p5.

El AAV se replica a través de un intermedio dúplex de ADN que es una molécula continua: ambas cadenas están unidas covalentemente a través de la ITR. Las proteínas Rep p5 son capaces de reconocer un resto en la ITR, mellar una cadena del dúplex y unirse covalentemente a través de la unión fosfodiéster tirosinil-timidina en el extremo 5' de la mella. Se cree que la actividad helicasa de Rep es responsable del desenrollamiento del extremo 5' recién creado y un complejo de polimerasa celular extiende el extremo 3' en hueco para generar un intermedio de replicación en dúplex, con extremos romos. Las proteínas Rep menores retienen la actividad helicasa de ADN dependiente de ATP y están implicadas en la encapsidación de los genomas del virión monocatenarios. Rep52 y Rep40 se asocian con las cápsides preformadas y, presumiblemente, desenrollan los intermedios de replicación en dúplex.

En los últimos años, AAV ha surgido como un vector viral preferido para la terapia génica debido a su capacidad para infectar eficazmente tanto células que no se dividen como en división, integrarse en un único sitio cromosómico en el genoma humano y presentar un riesgo patogénico relativamente bajo para los seres humanos. A la vista de estas ventajas, el virus adeno-asociado recombinante (rAAV) se está usando actualmente en los ensayos clínicos de terapia génica para la hemofilia B, melanoma maligno, fibrosis quística y otras enfermedades.

Las secuencias de AAV empleadas para la producción de AAV en células de insecto pueden obtenerse del genoma de cualquier serotipo de AAV. Generalmente, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas con identidad de secuencia significativa a los niveles de aminoácidos y ácido nucleico, proporcionan un conjunto virtualmente idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente físicamente y funcionalmente equivalentes y se replican y ensamblan por mecanismos prácticamente idénticos. Para la secuencia gnómica de los serotipos de AAV y una discusión de las similitudes genómicas, véanse, por ejemplo, número de Registro de GenBank U89790; número de Registro de GenBank J01901; número de Registro de GenBank AF043303; número de Registro de GenBank AF085716; Chiorini et al., J. Vir. 71: 6823-33 (1997) ; Srivastava et al., J. Vir. 45: 555-64 (1983) ; Chiorini et al., J. Vir. 73: 1309-1319 (1999) ; Rutledge et al., J. Vir. 72: 309-319 (1998) ; y Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000) .

Las dificultades implicadas en el aumento de escala de la producción de rAAV usando los sistemas actuales de producción de células de mamífero pueden ser significativos, si no completamente prohibitivos. Por ejemplo, para determinados estudios clínicos pueden requerirse más de 1015 partículas de rAAV. Para producir este número de partículas de rAAV en una línea celular de mamífero tal como células 293 humanas, se requeriría la transfección y cultivo de aproximadamente 1011 células, el equivalente a 5.000 matraces de... [Seguir leyendo]

1. Un casete de ácido nucleico para expresar en una célula de insecto una pluralidad de polipéptidos codificados por un gen que comprende marcos de lectura abiertos (ORF) superpuestos, comprendiendo el casete, en orden 5' a 3':

a) un primer promotor operativo en células de insecto;

b) una parte 5' de un primer ORF del gen;

c) un intrón que comprende un segundo promotor operativo en células de insecto; y d) una parte 3' del primer ORF del gen, en el que la parte 3' del primer ORF se superpone con al menos un ORF adicional y en el que el primer promotor operativo en células de insecto está unido de manera operativa al primer ORF; el primer ORF comprende un primer codón de inicio de la traducción; el segundo promotor operativo en células de insecto está unido de manera operativa al menos al un ORF adicional y el al menos un ORF adicional comprende al menos un codón de inicio de la traducción adicional y en el que al menos uno de a) , b) , c) y d) es heterólogo al menos a un otro de a) , b) , c) y d) .

2. Un casete de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además e) una señal de poliadenilación situada 3' respecto a d) .

3. Un vector que comprende le casete de ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. Un vector según la reivindicación 3, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un virus y una combinación de éstos.

5. Una célula de insecto in vitro que comprende un casete de ácido nucleico de la reivindicación 1.

6. Una célula de insecto in vitro según la reivindicación 5, que comprende un primer casete de ácido nucleico de la reivindicación 1 y un segundo casete de ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el primer casete de ácido nucleico comprende un gen Rep que comprende un ORF Rep 78/68 como el primer ORF y un ORF Rep 52/40 como el ORF adicional y el segundo casete de ácido nucleico comprende un gen Cap en el que el primer ORF es un ORF VP1 y el ORF adicional es un ORF VP2/VP3.

7. Una célula de insecto según la reivindicación 6, que comprende además un casete de ácido nucleico adicional, comprendiendo el casete adicional, en orden 5' a 3': una primera repetición terminal invertida (ITR) de un virus adeno-asociado; un promotor operativo en células de mamífero; un transgén;

una señal de poliadenilación; y una segunda ITR de un AAV.

8. Un cultivo celular que comprende: una pluralidad de células de insecto de la reivindicación 5; y un medio de cultivo.

9. Un cultivo celular que comprende: una pluralidad de células de insecto de la reivindicación 7; y un medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 1013 genomas de AAV/litro.

10. Un cultivo celular según la reivindicación 9, en el que el medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 1013 genomas de AAV/litro es un medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 1014 genomas de AAV/litro.

11. Un método para expresar una pluralidad de polipéptidos codificados por un gen que comprende ORF superpuestos, comprendiendo el método:

a) infectar o transfectar al menos una célula de insecto con un casete de ácido nucleico de la reivindicación 1; y b) cultivar la al menos una célula de insecto.

12. Un método para producir virus adeno-asociados (AAV) en una célula de insecto, comprendiendo el método: a) proporcionar una o más células de insecto de la reivindicación 7; y

b) cultivar la una o más células de insecto en un medio de cultivo.

13. Un método para producir cápsides de AAV in vitro, comprendiendo el método: a) proporcionar una o más células de insecto que comprenden un casete de ácido nucleico de la reivindicación 1, en el

que el gen que comprende ORF superpuestos es un gen Cap de un AAV; y 5 b) cultivar la una o más células de insecto en un medio de cultivo.

14. Un método para producir genomas de AAV in vitro, comprendiendo el método: a) proporcionar una o más células de insecto que comprenden el casete de ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el gen que comprende ORF superpuestos es un gen Rep de un virus adeno-asociado (AAV) y el primer ORF es un ORF Rep78/68 y el al manos un ORF adicional es un ORF Rep 52/40 y un casete de ácido nucleico adicional, comprendiendo el casete adicional, en orden 5' a 3': una primera repetición terminal invertida (ITR) de un virus adeno-asociado; un promotor operativo en células de mamífero; un transgén; una señal de poliadenilación; y una segunda ITR de un AAV; y b) cultivar la una o más células de insecto en un medio de cultivo.