Exosomas derivados de reticulocitos infectados con plasmodium sp.

, método para su obtención y su uso.

La presente invención pertenece al campo de la vacunas para la prevención y profilaxis contra la malaria, más concretamente se refiere a un exosoma aislado a partir de reticulocitos infectados con Plasmodium sp., al método para su obtención y a su uso para la prevención y profilaxis frente a la malaria.

Exosomas derivados de reticulocitos infectados con Plasmodium sp., método para su obtención y su uso.

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de las vacunas para la prevención y profilaxis contra la malaria, más concretamente se refiere a un exosoma aislado a partir de reticulocitos infectados con Plasmodium sp., al método para su obtenciónyasuuso para la prevención y profilaxis frente a la malaria.

Antecedentes de la invención Plasmodium sp., es el agente etiológico causante de la malaria, también conocida como paludismo. Dentro del genero Plasmodium hay diferentes especies algunas de las cuales son inocuas. Otras especies, por el contrario, son altamente infecciosas y son la causa de la mayor parte de los casos de malaria humana a nivel mundial. Entre estas últimas, las especies más importantes son P. falciparum, y P. vivax.

Todas las especies humanas de Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale) infectan en mayor o menor medida a eritrocitos y/o a los precursores de estos los reticulocitos que requieren un proceso de maduración y diferenciación para alcanzar su estadio funcional final como eritrocitos. De entre las diferentes especies de Plasmodium existen algunas que tienen mayor capacidad de infección de reticulocitos que otras como, por ejemplo, Plasmodium vivax que infecta predominantemente este tipo de células.

Dentro del proceso de maduración y diferenciación de reticulocitos a eritrocitos, algunas proteínas que no son necesarias para estos últimos son secuestradas en vesículas internas localizadas en cuerpos multivesiculares "multivesicular bodies" (MVBs) y posteriormente liberadas al medio extra-celular como pequeñas nano-vesículas conocidas como exosomas.

Recientemente, la investigación de exosomas ha sido estimulada tras el hallazgo que otras células, tales como las células presentadoras de antígenos, son capaces de secretar este tipo de nano-vesículas sugiriendo un papel más allá del originalmente descrito en la maduración y diferenciación de reticulocitos. De hecho, varios estudios con diferentes tipos de células han revelado que los exosomas juegan un papel en la regulación del sistema inmune al transferir información entre células durante la respuesta inmune, y, por lo tanto, representan un nuevo modo de comunicación inter-celular (Schorey and Bhatnagar, 2008) . En esta línea, ha sido demostrada la capacidad protectora de exosomas en infecciones experimentales con Toxoplasma gondii, miembro del phylum Apicomplexa al que pertenece también Plasmodium (Bhatnagar et al., 2007) .

Además, se han descrito varias estrategias basadas en el uso de exosomas como agentes profilácticos o inmunoestimuladores (Viaud et al. Exosomes for the treatment of human malignancies. Horm Metabl Res 2008, 40:82) .

Entre otras, WO9705900 describe exosomas obtenidos a partir de células presentadoras de antígenos como células B, macrófagos o células dendríticas. Los exosomas descritos en este documento tienen la particularidad de que al ser obtenidos a partir de células presentadoras de antígeno, los antígenos son presentados en el contexto MHC-I y MHC-

II.

Por su parte, el documento EP1523990 describe exosomas obtenidos a partir de células cancerígenas (identificados como texosomas) o a partir de células dendríticas cargadas o no de antígenos (este documento los denomina dexosomas) .

WO2004014954 utiliza una estrategia diferente ya que para obtener exosomas que muestren en su superficie un antígeno deseado, se transfectan células de la línea CT26 (cáncer de colon murino) y células de la línea TA3HA (carcinoma mamario de ratón) con virus recombinantes que comprenden en su genoma la secuencia que codifica el antígeno deseado (muc-1) que es así expresado en la superficie de los exosomas aislados a partir de este tipo de células.

WO0028001 describe exosomas obtenidos a partir de mastocitos esencialmente desprovistos de moléculas MHC endógenas. Los exosomas descritos en este documento si expresan en su superficie, sin embargo, MHC recombinantes.

Por último, WO2008092153 describe exosomas obtenidos a partir de células cancerosas y desprovistas de uno o más polipéptidos inmunosupresivos normalmente presentes en los exosomas.

Los autores de la presente invención han desarrollado ahora una nueva estrategia en la prevención y profilaxis de la malaria basada en el uso de exosomas aislados a partir de reticulocitos de sujetos o modelos murinos infectados con Plasmodium. Estos exosomas son obtenidos por aislamiento de la fracción de exosomas derivados de reticulocitos a partir de sangre infectada con Plasmodium.

Breve descripción de las figuras Figura 1: representa la caracterización de exosomas aislados a partir de plasma de ratones. (A) Análisis de tamaño por dispersión dinámica de luz. (B) Tinción negativa después de una fijación con paraformaldehído al 2%. La escala representa 100 nm.

Figura 2: representa la evolución en el tiempo de parasitemia y el análisis del tropismo celular de ratones inmunizados con exosomas. Las curvas de parasitemia fueron calculadas de la media de 2 ratones controles no infectados, 2 ratones controles infectados con exosomas aislados de animales normales, de 3 ratones infectados con exosomas obtenidos de animales infectados con la cepa no letal de P. yoelli, y de 3 ratones infectados con exosomas obtenidos de animales infectados con la cepa letal de P. yoelli. Tinción de Giemsa de extendidos de sangre periférica en el día antes de sacrificar de un animal representativo de cada grupo.

Figura 3: análisis por Western blot de la respuesta de anticuerpos IgG anti-P. yoelli en suero de animales inmunizados con exosomas. Las muestras fueron colectadas por punción maxilar en el día 20 después de la segunda inmunización. Cada panel corresponde a una mezcla de sueros de cada grupo de animales utilizados en estos experimentos. En el Western blot fue utilizado antígeno total obtenido de las cepas no-letal (AgNL) y letal (AgL) , de P. yoelli y las respuestas de anticuerpos IgG fueron detectadas mediante el uso de suero de cabra conjugado a fosfatasa alcalina y producido contra la IgG de ratón.

Figura 4: representa un análisis por tinción intra-celular de células T, CD4+ y CD8+ en animales inmunizados con exosomas de la cepa no-letal de P. yoelli. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 5 microgramos de exosomas PyNL en CpG-ODN. Dos semanas después de la primera inmunización, se realizó un refuerzo con 5 microgramos de exosomas sin CpG-ODN. (A) El porcentaje de linfocitos que son CD8+ IFN-γ+ fue calculado después de una reestimulación in vitro, tinción intra-celular y análisis por citometría de flujo. El porcentaje de linfocitos CSFE+ que son CD4+ IFN-γ+ está representado en (B) y el de CD4+IFN-γ+ IL-2+ en (C) . Los datos corresponden a un experimento y son expresados como la media ± error estándar de 3 ratones no inmunizados y 3 ratones inmunizados con exosomas provenientes de ratones infectados con la cepa no letal exPyNL.

Figura 5: (A) - (D) espectro MS/MS resultante del análisis proteómico de los antígenos presentes en exosomas derivados de reticulocitos provenientes de ratones infectados con P. yoelli y de un paciente infectado con P. vivax. El análisis bioinformático del espectro confirma la presencia de antígenos tanto de P. yoelli como de P. vivax en las muestras de exosomas analizadas.

Descripción detallada de la invención El primer objeto de la presente invención viene representado por un exosoma aislado a partir de plasma que comprende al menos un antígeno de Plasmodium sp. en su interior o en su superficie (a partir de ahora exosomas de la invención) .

Los exosomas de la invención han demostrado capacidad inmunogénica frente a la malaria por lo que resultan de gran potencial utilidad en la preparación de una vacuna para la prevención y profilaxis de esta enfermedad.

El antígeno o antígenos presentes en los exosomas de la presente invención pueden provenir de cualquier especie de Plasmodium. En una realización particular de la invención el antígeno o antígenos presentes en los exosomas provienen de P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. yoelli, P. achiotense, P. achromaticum, P. aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P. azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P. bigueti P. brasilianum, P. br y gooi, P. booliati, P. bubalis, P. bucki, P. coatneyi, P. cathemerium,... [Seguir leyendo]

1. Exosoma aislado a partir de reticulocitos que comprende al menos un antígeno de Plasmodium sp en su interior o en su superficie.

2. Exosoma de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicho antígeno o antígenos presentes en el exosoma pertenecen a Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli P. achiotense, P. achromaticum, P. aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P. azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P. bigueti P. brasilianum, P. br y gooi, P. booliati, P. bubalis, P. bucki, P. coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P. chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P. coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P. coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P. diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. dominicana, P. durae, P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P. fairchildi, P. fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P. floridense, P. fragüe, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum, P. giovannolai, P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P. gracilis, P. griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense, P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P. hexamerium, P. holaspi, P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P. inopinatum, P. inui, P. jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P. kempi, P. knowlesi, P. kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P. lophurae, P. lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P. mackerrasae, P. maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum, P. mexicanum, P. minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P. octamerium, P. odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P. parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi, P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P. polare, P. praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P. rhodaini, P. robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P. schweitzi, P. silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P. smirnovi, P. subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P. torrealbai, P. traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi, P. watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P. vinckei, P. volans y/o P. youngi.

3. Exosoma de acuerdo con la reivindicación 2 donde dicho antígeno o antígenos presentes en el exosoma pertenecen a Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P. berghei, P. brasilianum, P. chabaudi, P. cynomolgi, P. fragüe, P. knowlesi y/o P. reichenowi.

4. Exosoma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde dicho exosoma ha sido aislado a partir de reticulocitos de mono, de ratón y/o humanos.

5. Uso de un exosoma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en la elaboración de un medicamento para la prevención y profilaxis frente a la malaria.

6. Método para la obtención de los exosomas de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

a) obtener una muestra de sangre infectada con Plasmodium sp., b) obtener la fracción de exosomas derivada de reticulocitos mediante ultracentrifugación secuencial de la muestra de sangre de a) .

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6 donde la muestra de sangre puede estar infectada con Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli P. achiotense, P. achromaticum, P. aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. anasum, P. atheruri, P. azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. berghei, P. bigueti P. brasilianum, P. br y gooi, P. booliati, P. bubalis, P. bucki, P. coatneyi, P. cathemerium, P. cephalophi, P. chabaudi, P. chiricahuae, P. circularis, P. cnemidophori, P. coatneyi, P. coggeshalli, P. colombiense, P. corradettii, P. coturnix, P. coulangesi, P. cuculus, P. popo, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P. diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. dominicana, P. durae, P. egerniae, P. elongatum, P. eylesi, P. fabesia, P. fairchildi, P. fallax, P. fieldi, P. foleyi, P. forresteri, P. floridense, P. fragile, P. garnhami, P. gallinaceum, P. giganteum, P. giovannolai, P. girardi, P. gonatodi, P. gonderi, P. georgesi, P. gracilis, P. griffithsi, P. guanggong, P. gundersi, P. guyannense, P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. heteronucleare, P. hexamerium, P. holaspi, P. huffi, P. hylobati, P. icipeensis, P. inopinatum, P. inui, P. jefferi, P. josephinae, P. juxtanucleare, P. kempi, P. knowlesi, P. kentropyxi, P. leanucteus, P. lemuris, P. lophurae, P. lepidoptiformis, P. lygosomae, P. mabuiae, P. mackerrasae, P. maculilabre, P. maior, P. marginatum, P. matutinum, P. mexicanum, P. minasense, P. morulum, P. nucleophilium, P. octamerium, P. odocoilei, P. papernai, P. paranucleophilum, P. parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. petersi, P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P. polare, P. praecox, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P. rhodaini, P. robinsoni, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P. schweitzi, P. silvaticum, P. simium, P. semiovale, P. shortii, P. smirnovi, P. subpraecox, P. tenue, P. tejerai, P. tomodoni, P. torrealbai, P. traguli, P. tribolonoti, P. tropiduri, P. uilenbergi, P. watteni, P. wenyoni, P. vacuolatum, P. vastator, P. vaughani, P. vinckei, P. volans y/o P. youngi.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7 donde la muestra de sangre puede estar infectada con Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium yoelli, P. berghei, P. brasilianum, P. chabaudi, P. cynomolgi, P. fragile, P. knowlesi y/o P. reichenowi.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 6 donde la ultracentrifugación secuencial de la etapa b) comprende: i) centrifugar entr.

40. 900 x g durant.

2. 35 minutos ii) centrifugar entre 10 000-14 000 x g durant.

2. 40 minutos iii) centrifugar entre 90 000-110 000 x g durante 1 -3 horas.

10. Composición farmacéutica que comprende exosomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Vacuna frente a la malaria que comprende exosomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones1a4.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200931275

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 28.12.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

87. 881, página 871, resumen; página 877, column.

2. página 878, columna 1. 1-11 A VIAUD S. et al. Exosomes for the Treatment of Human Malignancies. Horm Metab Res. 2008. Volumen 40, página.

8. 88, página 82, resumen; página 86, column.

2. página 87, columna 1. 1-11 A WO 2008092153 A2 (UNIVERSITY OF LOUISVILLE RESEARCH FOUNDATION) 31.07.2008, página 4, línea 25 - página 7, línea 11. 1-11 A ENGWERDA ChR. et al. The importance of the spleen in malaria. TRENDS in Parasitology. 2005. Volumen 21 (2) , página.

7. 80, página 77, columnas 1 y 2. 1-11 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 22.03.2011 Examinador M. García Grávalos Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200931275

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

G01N33/569 (2006.01) A61K39/015 (2006.01) A61P31/00 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

G01N, A61K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, GOOGLE SCHOLAR, GOOGLE PATENTES, USPTO PATENT DATABASE

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931275

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 22.03.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931275

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

87. 881. 2008 D03 VIAUD S. et al. Horm Metab Res. 2008. Volumen 40, página.

8. 88.. 2008 D04 WO 2008092153 A2 31.07.2008 D05 ENGWERDA ChR. et al. TRENDS in Parasitology. 2005. Volumen 21 (2) , página.

7. 80. 2005

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente invención divulga un exosoma, aislado de reticulocitos de mono, ratón y/o humanos, que contiene al menos un antígeno de Plasmodium sp. (reivindicaciones 1-4) , al método para su obtención y a su uso para elaborar un medicamento, composición farmacéutica y/o vacuna para prevención y profilaxis de la malaria (reivindicaciones 5-11) .

El documento D01 divulga el uso de exosomas en una vacuna frente a toxoplasmosis congénita en ratones, así como su posible uso en humanos como un nuevo tipo de vacuna que no contiene células sino exosomas que presentan antígenos y que transfieren material biológico entre células, constituyendo una diana inmunológica capaz de inducir una respuesta inmune efectiva (ver todo el documento) .

El documento D02 se refiere a un estudio sobre los exosomas y sus funciones biológicas, entre ellas la de candidatos a posibles vacunas frente a enfermedades infecciosas, debido a que los exosomas aislados de células infectadas con patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis o Toxoplasma gondii contienen componentes microbianos y pueden promover la presentación de antígenos y la activación de macrófagos (ver página 871, resumen; página 877, column.

2. página 878, columna 1) .

El documento D03 se refiere al uso de exosomas para tratamiento de enfermedades humanas, especialmente en su potencial como vacunas libre de células para combatir el cáncer. También se refiere a su capacidad de presentar antígenos específicos que producen una respuesta inmune efectiva frente a infecciones como las provocadas por Toxoplasma gondii lo que hace que se las considere como potenciales vacunas frente a este y otros microorganismos patógenos (ver página 82, resumen; página 86, column.

2. página 87, columna 1) .

El documento D04 divulga un exosoma aislado de una célula, que comprende uno o más antígenos, incluso antígenos exógenos, y que es deficiente en uno o más de los polipéptidos inmunosupresores que normalmente se encuentran en estas moléculas. También se refiere a métodos de obtención de dichos exosomas y a su uso para tratamiento de cancer (ver página 4, líne.

25. página 7, línea 11) .

El documento D05 se refiere a la importante función del bazo en el desarrollo de la malaria. Este órgano, es un lugar clave para renovación de los glóbulos rojos parasitados durante la malaria, donde se genera inmunidad y producción de nuevos glóbulos rojos. Este estudio sugiere que cuando el antígeno es capturado por las células dendríticas, presentadoras de antígeno, para generar la respuesta inmune, la transferencia del antígeno puede realizarse por exosomas o por fagocitosis de macrófagos. (ver página 77, columnas 1 y 2) .

1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)

El objeto técnico de la presente solicitud es un exosoma, que contiene al menos un antígeno de Plasmodium sp., un método para su obtención y su uso para elaborar un medicamento y/o vacuna para prevención y profilaxis de la malaria

1.1. 1-11

El documento D01 se considera el más cercano al estado de la técnica ya que anticipa el uso de exosomas en una vacuna frente a toxoplasmosis congénita en ratones y su posible uso en humanos.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931275

Los documentos D02 y D03 también anticipan el uso de exosomas, aislados de células infectadas con patógenos intracelulares, como Mycobacterium tuberculosis o Toxoplasma gondii, contienen componentes microbianos y pueden promover la presentación de antígenos como posibles vacunas libres de células.

Aunque el uso de los exosomas para elaboración de vacunas y es conocido en el estado de la técnica, sin embargo, la presente invención difiere de los documentos anteriormente citados en que reivindica un exosoma que contiene al menos un antígeno de Plasmodium sp., que puede ser de diferentes especies de Plasmodium, que se obtiene de sangre infectada con este organismo y su uso para elaborar un medicamento para prevención y profilaxis de la malaria, enfermedad difícil de combatir y de encontrar una vacuna específica para ella. Por tanto, se considera que invención divulgada en la presente solicitud resulta inventiva ya que supone una mejora considerablemente respecto a lo divulgado en el estado de la técnica.

En consecuencia, según lo divulgado en los documentos D01-D03, las reivindicaciones 1-11 cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986) .

Los documentos D04 y D05 se refieren al estado de la técnica y no se consideran relevantes en relación con el objeto de la invención.

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