Estuche y método de ensayo de células.

Un método para ensayar una muestra de células por la presencia de al menos una concentración umbral decélulas de un tipo determinado,

que comprende:

(a) hacer reaccionar una muestra de células que contiene células del tipo de células determinado con partículascapaces de unión específica a las células y que son eficaces, cuando se unen a las células, para aumentar ladensidad o susceptibilidad magnética de las células, permitiendo que se separen células ligadas a partículas ypartículas libres de células no ligadas a partículas en la muestra basado en su mayor velocidad de migración por unmedio seleccionado bajo la influencia de una fuerza gravitatoria o centrífuga aplicada o de campo magnético,

(b) hacer que las células unidas a partículas y las partículas en la muestra de células migren por una cámara derecogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entre 10 - 500 micrómetros y que contiene el medioseleccionado y que tiene a lo largo de su longitud, una pluralidad de regiones de recogida de células, sometiendo lamuestra a una fuerza gravitatoria o centrífuga seleccionada o de campo magnético durante un periodo de tiemposuficiente para causar sustancialmente que todas las células unidas a partículas y las partículas llenencompletamente regiones de recogida de células sucesivas en la cámara de recogida e

(c) inspeccionar la cámara para determinar si al menos una región de recogida seleccionada se llena parcialmente ocompletamente, como demuestra que la muestra de células contenga al menos una concentración umbral de célulasdel tipo de células determinado

Estuche y método de ensayo de células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un estuche y método de ensayo de células para determinar la presencia y/o la concentración de células de un tipo determinado en una muestra de células y en particular la presencia de al menos un nivel umbral seleccionado de las células en la muestra.

Antecedentes de la invención

Una variedad de enfermedades, incluyendo la respuesta al tratamiento de una condición patológica, se puede controlar mediante marcadores hematológicos, usando la concentración aproximada de ciertos glóbulos blancos en una muestra de sangre como un indicador de la respuesta corporal a la enfermedad. Por ejemplo, la concentración de células linfocíticas T CD4+ en una muestra de sangre puede proporcionar un marcador para el comienzo de SIDA tras infección por VIH. Un recuento de células de menos de aproximadamente 200 células/μl de sangre que indica un sistema inmunitario seriamente debilitado y así la necesidad de comenzar inmediatamente con, por ejemplo, tratamiento antirretroviral (ART, por sus siglas en inglés) . Algunas enfermedades, tales como la infección vírica o bacteriana, se caracterizan por una concentración aumentada de leucocitos sanguíneos, por ejemplo, por encima de aproximadamente 10.000 células/μl de sangre, que puede servir así como un indicador de una condición patológica infecciosa. A la inversa, la concentración de leucocitos en una muestra de sangre se puede reducir, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 4.000 células/μl de sangre, en un individuo que tiene leucemia o que se está sometiendo a quimioterapia o tratamiento con radiación. En estas y otras enfermedades que se caracterizan por niveles reducidos o elevados de un tipo de glóbulos blancos, se puede usar el nivel de las células marcadoras para detectar o confirmar una enfermedad o controlar la respuesta corporal al tratamiento de la afección.

En la actualidad, hay dos métodos hematológicos generales que se emplean comúnmente para determinar la concentración de una célula determinada en una muestra de células. En una primera propuesta, el tipo de célula de interés se marca con un marcador que se une específicamente a ese tipo de célula, típicamente un anticuerpo específico para antígenos. Se analiza después la muestra de células con un contador de células, por ejemplo, un citómetro de flujo o un Separador Celular Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) para determinar el porcentaje de células con el marcador ligado a la superficie.

La segunda propuesta general es marcar células de interés y examinar un volumen de células representativo por examen microscópico, contando el número de células marcadas y no marcadas para determinar un porcentaje del tipo de célula de interés.

En las dos propuestas, en particular en el caso en que se desee determinar la concentración de un tipo de células blancas determinado, primero se puede tratar la muestra de células para eliminar los glóbulos rojos u otras células no deseadas.

Los métodos explicados en líneas generales anteriormente son aptos para los marcos de laboratorio o clínicos en que se dispone de personal de laboratorio especializado y equipo de separación celular o histológico. Sin embargo, no se prestan fácilmente a campos, tales como consultorios en centros comerciales o consultorios de campo en países del tercer mundo, donde no hay personal de laboratorio especializado ni equipo sofisticado de separación celular o de microscopía. En áreas más pobres de África, por ejemplo, estos métodos pueden ser inapropiados para ensayar recuentos de células T CD4+ en un gran número de personas, como un indicio del comienzo del SIDA tras infección por VIH o para controlar la respuesta de una persona, por ejemplo, a fármacos antirretrovirales.

Sería así deseable proporcionar un estuche y método económico, rápido, simple, para la determinación de recuentos de células sobre células relacionadas con la enfermedad, por ejemplo, células blancas seleccionadas en una muestra de sangre. En particular, dicho método y estuche deberían ser fácilmente realizables con sólo un mínimo aprendizaje y requerir poco o ningún equipo de laboratorio especial, por ejemplo, más allá de una simple, por ejemplo centrífuga de sobremesa accionada de manera manual.

La patente de EE.UU. A-5646004 desvela métodos de ensayo de muestras de células pero no se desvela una cámara de recogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entre 10 – 500 micrómetros.

Sumario de la invención

La invención incluye, en un aspecto, un método para ensayar una muestra de células por la presencia de al menos una concentración umbral de células de un tipo determinado.

La invención, en su forma más amplia, se define por las reivindicaciones independientes 1 y 16. Se definen realizaciones preferidas por las reivindicaciones 2-15 y 17-33:

1. Un método para ensayar en una muestra de células la presencia de al menos una concentración umbral de células de un tipo determinado, que comprende:

(a) hacer reaccionar una muestra de células que contiene células del tipo de células determinado con partículas capaces de unirse de manera específica a las células y que son eficaces, cuando se unen a las células, para aumentar la densidad o la susceptibilidad magnética de las células, permitiendo que se separen las células ligadas a partículas y las partículas libres de las células no ligadas a partículas en la muestra basándose en su mayor velocidad de migración por un medio seleccionado bajo la influencia de una fuerza gravitatoria o centrífuga aplicada

o de campo magnético,

(b) hacer que las células ligadas a partículas y las partículas en la muestra de células migren por una cámara de recogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entre 10 - 500 micrómetros y que contiene el medio seleccionado y que tiene a lo largo de su longitud, una pluralidad de regiones de recogida de células, sometiendo la muestra a una fuerza gravitatoria o centrífuga seleccionada o de campo magnético durante un periodo de tiempo suficiente para hacer que sustancialmente todas las células ligadas a partículas y las partículas llenen completamente regiones de recogida de células sucesivas en la cámara de recogida e

(c) inspeccionar la cámara para determinar si se llena parcialmente o completamente al menos una región de recogida seleccionada, como prueba de que la muestra de células contiene al menos una concentración umbral de células del tipo de células determinado.

16. Un estuche para ensayar en una muestra de células la presencia en la muestra de al menos una concentración umbral de células de un tipo de células seleccionado, que comprende:

(a) un dispositivo de ensayo que tiene una cámara de muestra para admitir la muestra de células y, en comunicación de fluido con la misma, una cámara de recogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entre 10 - 500 micrómetros y que contiene un medio seleccionado y que tiene a lo largo de su longitud, una pluralidad de regiones de recogida de células,

(b) partículas que, cuando se añaden a la muestra de células, son capaces de unirse de manera específica a células del tipo de células seleccionado, y que son eficaces, cuando se unen a las células, para aumentar la densidad o la susceptibilidad magnética de las células, permitiendo que las células ligadas a partículas y las partículas en la muestra de células migren preferentemente por la cámara de recogida alargada bajo la influencia de una fuerza gravitatoria o centrífuga seleccionada o de campo magnético hasta que sustancialmente todas las células ligadas a partículas y las partículas llenen completamente las regiones de recogida de células sucesivas en la cámara de recogida e

(c) indicios asociados con al menos una región de recogida en la cámara de recogida del dispositivo que indiquen la concentración de células del tipo seleccionado eficaz para al menos llenar parcialmente esa región de recogida, cuando se extraen células ligadas a partículas y partículas libres por la cámara de recogida.

Las partículas, cuando se unen a las células en la etapa (a) , pueden ser eficaces para marcar las células con un... [Seguir leyendo]

1. Un método para ensayar una muestra de células por la presencia de al menos una concentración umbral de células de un tipo determinado, que comprende:

(a) hacer reaccionar una muestra de células que contiene células del tipo de células determinado con partículas capaces de unión específica a las células y que son eficaces, cuando se unen a las células, para aumentar la densidad o susceptibilidad magnética de las células, permitiendo que se separen células ligadas a partículas y partículas libres de células no ligadas a partículas en la muestra basado en su mayor velocidad de migración por un medio seleccionado bajo la influencia de una fuerza gravitatoria o centrífuga aplicada o de campo magnético,

(b) hacer que las células unidas a partículas y las partículas en la muestra de células migren por una cámara de recogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entr.

10. 500 micrómetros y que contiene el medio seleccionado y que tiene a lo largo de su longitud, una pluralidad de regiones de recogida de células, sometiendo la muestra a una fuerza gravitatoria o centrífuga seleccionada o de campo magnético durante un periodo de tiempo suficiente para causar sustancialmente que todas las células unidas a partículas y las partículas llenen completamente regiones de recogida de células sucesivas en la cámara de recogida e

(c) inspeccionar la cámara para determinar si al menos una región de recogida seleccionada se llena parcialmente o completamente, como demuestra que la muestra de células contenga al menos una concentración umbral de células del tipo de células determinado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la cámara de recogida incluye una columna de recogida de microcanales, donde las regiones de recogida dentro de la columna incluyen segmentos de longitud definida a lo largo de una sección de la columna y las regiones de recogida se llenan sucesivamente en la etapa (b) en una dirección aguas abajo a aguas arriba a lo largo de la longitud de la columna de la cámara de recogida.

3. El método según la reivindicación 2, en el que la muestra de células reacciona en la etapa (a) con una cantidad determinada de partículas capaces de unión específica al tipo de células determinado, donde las partículas hacen una contribución mensurable al volumen de células ligadas a partículas que migran a la cámara de recogida en la etapa (b) y la etapa (c) incluye ajustar el volumen de células ligadas a partículas en las regiones de recogida de la cámara de recogida para compensar el volumen de partículas.

4. El método según la reivindicación 1, en el que dichas partículas, cuando se unen a las células en la etapa (a) son eficaces para marcar las células con un indicador detectable y dicha inspección incluye inspeccionar de manera visual en la cámara de recogida la presencia de células marcadas con el indicador detectable.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) incluye someter las células ligadas a partículas a fuerza gravitatoria poniendo la cámara en una posición dispuesta de manera vertical, sustancialmente de pie, el medio de densidad seleccionado presenta una densidad menor que la de las células ligadas a partículas y las partículas son partículas de metal sustancialmente esféricas.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) incluye someter las células unidas a partículas a una fuerza centrífuga, el medio de densidad seleccionado presenta una densidad menor que la de las células unidas a partículas y las partículas son partículas de metal sustancialmente esféricas.

7. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) incluye someter las células ligadas a partículas a una fuerza de campo magnético y las partículas son partículas magnéticas o paramagnéticas sustancialmente esféricas.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) incluye además añadir la muestra que contiene células ligadas a partículas a una zona de interfase aguas arriba de la cámara de recogida y mezclar de manera física la muestra con un medio de densidad seleccionada en la zona de interfase.

9. El método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de sangre, teniendo dichas partículas proteína de unión ligada a la superficie capaz de inmunoreaccionar con un antígeno específico de células sanguíneas y las partículas son tratadas superficialmente para reducir la agregación de partículas en una muestra de sangre.

10. El método según la reivindicación 9, para detectar la concentración de células linfocíticas T CD4+ en una muestra de sangre de un individuo que puede estar infectado con VIH, como un indicador de la categoría de células T del individuo, en el que la etapa (a) de reacción se realiza por exposición de una muestra de fluido de sangre del individuo a partículas con agente de unión anti-CD4+ ligado a la superficie y la etapa (c) se basa en la observación de la presencia de células en una región de recogida que indica una concentración de células linfocíticas T CD4+ con un valor umbral seleccionado entr.

20. 750 /μl de sangre.

11. El método según la reivindicación 9, en el que la etapa (a) incluye además hacer reaccionar células en la muestra con partículas capaces de unirse específicamente a antígeno CD14 en células monocíticas simultáneamente o seguido por reacción con segundas partículas capaces de unirse específicamente a antígeno CD4 en células linfocíticas T, para conferir así en las células linfocíticas T, densidad o susceptibilidad magnética aumentada y en las células monocíticas, tanto densidad como susceptibilidad magnética aumentada y la etapa (b) incluye además primero eliminar monocitos ligados a partículas de la muestra de células por aplicación de una fuerza eficaz para eliminar de manera selectiva los monocitos ligados a partículas de células linfocíticas T ligadas a partículas.

12. El método según la reivindicación 9, para detectar la concentración de leucocitos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener una infección u otra afección que conduzca a una elevación de leucocitos en la sangre, en el que la etapa (a) de reacción se realiza por exposición de una muestra de fluido de sangre del individuo a partículas con agente de unión anti-leucocitos ligado a la superficie y la etapa (c) se basa en observar la presencia de células en una región de recogida, que indica una concentración de leucocitos mayor que aproximadamente

10.000 células/μl de sangre.

13. El método según la reivindicación 9, para controlar la concentración de leucocitos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener números reducidos de leucocitos en la sangre, debido a quimioterapia, tratamiento con radiación o leucemia, en el que la etapa (a) de reacción se realiza por exposición de una muestra de fluido de sangre del individuo a partículas con agente de unión anti-leucocitos ligado a la superficie y la etapa (c) se basa en observar la presencia de células en una región de recogida que indica una concentración de leucocitos menor que aproximadamente 4.000 células/μl de sangre.

14. El método según la reivindicación 9, para controlar la concentración de neutrófilos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener números reducidos de neutrófilos en la sangre, debido a quimioterapia o tratamiento con interferón, en el que la etapa (a) de reacción se realiza por exposición de una muestra de fluido de sangre del individuo a partículas con agente de unión anti-neutrófilos ligado a la superficie y la etapa (c) se basa en observar la presencia de células en una región de recogida que indica una concentración de neutrófilos en un intervalo seleccionado entre 500 y 2.500 células /μl de sangre.

15. El método según la reivindicación 9, para detectar la concentración de células bacterianas en una muestra de fluido corporal de un individuo infectado, como un indicador de la extensión y el tipo de infección, en el que la etapa

(a) de reacción se realiza por exposición de una muestra de fluido corporal del individuo a partículas con un agente de unión ligado a la superficie capaz de unirse específicamente a uno o más antígenos de pared bacteriana seleccionados y la etapa (c) se basa en observar la presencia de células en una región de recogida que corresponde a una concentración detectable de células bacterianas en la muestra de sangre.

16. Un estuche para ensayar una muestra de células por la presencia en la muestra de al menos una concentración umbral de células de un tipo de células seleccionado, que comprende:

(a) un dispositivo de ensayo con una cámara de muestra para admitir la muestra de células y, en comunicación de fluido con la misma, una cámara de recogida alargada con dimensiones de ancho y profundidad entr.

10. 500 micrómetros y que contiene un medio seleccionado y que tiene a lo largo de su longitud, una pluralidad de regiones de recogida de células,

(b) partículas que, cuando se añaden a la muestra de células, son capaces de unirse de manera específica a células del tipo de células seleccionado y que son eficaces, cuando se unen a las células, para aumentar la densidad o susceptibilidad magnética de las células, permitiendo que células ligadas a partículas y partículas en la muestra de células migren de manera preferente por la cámara de recogida alargada bajo la influencia de una fuerza gravitatoria

o centrífuga seleccionada o de campo magnético hasta que sustancialmente todas las células ligadas a partículas y las partículas llenen completamente regiones de recogida de células sucesivas en la cámara de recogida e

(c) indicios asociados con al menos una región de recogida en la cámara de recogida del dispositivo, que indica la concentración de células del tipo seleccionado eficaz para llenar al menos parcialmente esa región de recogida, cuando se extraen células ligadas a partículas y partículas libres por la cámara de recogida.

17. El estuche según la reivindicación 16, en el que la cámara de recogida incluye una columna de recogida de microcanales, las regiones de recogida dentro de la columna incluyen segmentos de longitud definida a lo largo de una sección de la columna y las regiones de recogida están adaptadas para llenarse de manera sucesiva en la etapa en una dirección aguas abajo a aguas arriba a lo largo de la longitud de la columna de la cámara de recogida.

18. El estuche según la reivindicación 17, en el que la cámara de recogida incluye un conducto de recogida alargado y, formando las regiones de recogida dentro del conducto de recogida, una pluralidad de cavidades dispuestas dentro del conducto a lo largo de su longitud y las regiones de recogida están adaptadas para llenarse de manera sucesiva en una dirección aguas arriba a aguas abajo a lo largo de la longitud de la columna.

19. El estuche según la reivindicación 16, en el que la cámara de recogida incluye un conducto de recogida con una pluralidad de segmentos de flujo orientados en contraposición y, formando las regiones de recogida dentro del conducto de recogida, una pluralidad de cavidades con borde dispuestas entre segmentos de flujo adyacentes, de manera que las células que migran de un segmento de flujo a otro, en una dirección aguas arriba a aguas abajo, son atrapadas en la cavidad entre los dos segmentos de flujo hasta que se llena esa cavidad.

20. El estuche según la reivindicación 16, en el que la cámara de recogida incluye un conducto de recogida que está orientado con respecto a la dirección de flujo de las células unidas a partículas dentro del conducto bajo una fuerza gravitatoria y, formando las regiones de recogida dentro del conducto de recogida, una pluralidad de cavidades dispuestas a lo largo de una porción de superficie externa del conducto, de manera que las células que migran por el conducto de recogida, en una dirección aguas arriba a aguas abajo, son atrapadas en la cavidad más aguas arriba hasta que se llena.

21. El estuche según la reivindicación 16, en el que la cámara de recogida incluye un conducto de flujo que se extiende sustancialmente de manera transversal con respecto a la dirección de flujo de células unidas a partículas bajo una fuerza gravitatoria y, formando las regiones de recogida dentro de la cámara de recogida, una pluralidad de cavidades dispuestas a lo largo de una longitud del conducto de flujo, de manera que las células que fluyen por el conducto de flujo, en una dirección aguas arriba a aguas abajo, sedimentan en la cavidad más aguas arriba hasta que se llena, después de lo cual las cavidades se llenan sucesivamente en una dirección aguas arriba a aguas abajo.

22. El estuche según la reivindicación 16, en el que el dispositivo (a) incluye además una cámara de captación que comunica con la cámara de muestra y las partículas (b) incluyen un primer tipo de partículas capaces de unirse específicamente a un antígeno presente en células del tipo seleccionado y en células de un tipo no seleccionado y un segundo tipo de partículas capaces de unirse específicamente a un antígeno presente en células del tipo no seleccionado sólo, permitiendo que partículas ligadas al segundo tipo de partículas que se tienen que eliminar de manera selectiva por migración a la cámara de captación, antes de la migración de las células del tipo seleccionado, que están ligadas al primer tipo de partícula sólo, para migrar de manera selectiva a la cámara de recogida.

23. El estuche según la reivindicación 16, en el que dichas células ligadas a partículas son aptas para migrar por la zona de recogida bajo la influencia de una fuerza gravitatoria o centrífuga, en el que dichas partículas son partículas de metal sustancialmente esféricas.

24. El estuche según la reivindicación 16, para detectar células de un tipo determinado en una muestra de sangre, teniendo dichas partículas proteína de unión ligada a la superficie capaz de inmunoreaccionar con un antígeno específico de células sanguíneas.

25. El estuche según la reivindicación 24, en el que las partículas son tratadas de manera superficial para reducir la agregación de partículas en una muestra de sangre.

26. El estuche según la reivindicación 25, en el que dichas partículas se recubren con recubrimiento de polímero hidrófilo.

27. El estuche según la reivindicación 16, en el que dichas células ligadas a partículas son aptas para migrar por la zona de recogida bajo la influencia de una fuerza de campo magnético, en el que dichas partículas son partículas magnéticas o paramagnéticas sustancialmente esféricas.

28. El estuche según la reivindicación 16, para detectar la concentración de células linfocíticas T CD4+ en una muestra de sangre de un individuo que puede estar infectado con VIH, como un indicador de la categoría de células T del individuo, en el que dichas partículas tienen un agente de unión anti-CD4+ ligado a la superficie y dichos indicios se diseñan para indicar una concentración de células linfocíticas T CD4+ con un valor umbral seleccionado entr.

20. 750 /μl de sangre.

29. El estuche según la reivindicación 16, para detectar la concentración de leucocitos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener una infección u otra afección que conduzca a una elevación de leucocitos en la sangre, en el que dichas partículas tienen un agente de unión anti-leucocitos ligado a la superficie y dichos indicios se diseñan para indicar una concentración de leucocitos mayor que aproximadamente 10.000 células/μl de sangre.

30. El estuche según la reivindicación 16, para controlar la concentración de leucocitos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener números reducidos de leucocitos en la sangre, debido a quimioterapia, tratamiento con radiación o leucemia, en el que dichas partículas tienen un agente de unión anti-leucocitos ligado a la superficie y dichos indicios se diseñan para indicar una concentración de leucocitos menor que aproximadamente 4.000 células/μl de sangre.

31. El estuche según la reivindicación 16, para controlar la concentración de neutrófilos en una muestra de sangre de un individuo que puede tener números reducidos de neutrófilos en la sangre, debido a quimioterapia o tratamiento con interferón, en el que dichas partículas tienen un agente de unión anti-neutrófilos ligado a la superficie y dichos indicios se diseñan para indicar una concentración de neutrófilos en un intervalo seleccionado entre 500 y 2.500

células /μl de sangre.

32. El estuche según la reivindicación 16, para detectar la presencia de una infección bacteriana en una muestra de sangre u orina de un individuo infectado, en el que dichas partículas tienen un agente de unión ligado a la superficie capaz de unirse específicamente a un antígeno de la pared bacteriana y dichas regiones de recogida están

diseñadas para indicar la presencia de células en la muestra de sangre u orina.

33. El estuche según la reivindicación 16, que incluye además un soporte de dispositivo para soportar el dispositivo y aplicar al dispositivo soportado, una fuerza centrífuga o de campo magnético.