Método para identificar uno o más polimorfismos en muestras de ácido nucleico,

comprendiendo dichométodo las etapas de:

a) proporcionar una pluralidad de muestras de ácido nucleico de interés;

b) realizar una reducción de la complejidad en cada una de las muestras para proporcionar una pluralidadde bibliotecas de muestras de ácido nucleico,

c) ligar adaptadores a las muestras de ácido nucleico de complejidad reducida en las bibliotecas, usando undaptador que porta una proyección 3'-T;

d) secuenciar al menos una parte de las bibliotecas;

e) alinear las secuencias de cada muestra obtenida en la etapa d);

f) determinar uno o más polimorfismos entre la pluralidad de muestras de ácido nucleico en la alineación dela etapa e);

g) opcionalmente, examinar un ácido nucleico de muestra de prueba de interés para identificar la presencia,ausencia o cantidad del uno o más polimorfismos determinados en la etapa f) usando sondas de detección.

Estrategias para la identificación de alto rendimiento y la detección de polimorfismos

Campo técnico

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética. La invención se refiere a la rápida identificación de múltiples polimorfismos en una muestra de ácido nucleico. Los polimorfismos identificados pueden usarse para el desarrollo de sistemas de examen de alto rendimiento para detectar polimorfismos en muestras de prueba.

Antecedentes de la invención

La exploración del ADN genómico ha sido largamente deseada por la comunidad científica, en particular la médica. El ADN genómico contiene la clave para la identificación, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y enfermedad de Alzheimer. Además de la identificación y el tratamiento de la enfermedad, la exploración del ADN genómico puede proporcionar ventajas significativas en esfuerzos de cría de animales y plantas, lo que puede proporcionar respuestas a problemas de nutrición y alimentos en el mundo.

Se sabe que muchas enfermedades están asociadas con componentes genéticos específicos, en particular con polimorfismos en genes específicos. La identificación de polimorfismos en muestras grandes tales como genomas es en la actualidad una tarea laboriosa y que requiere mucho tiempo. Sin embargo, tal identificación es de gran valor en áreas tales como investigación biomédica, desarrollo de productos de farmacia, tipificación de tejidos, genotipado y estudios poblacionales.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método de identificación eficaz y detección fiable de polimorfismos en una muestra de ácido nucleico compleja, por ejemplo muy grande (por ejemplo ADN o ARN) de una manera rápida y económica usando una combinación de métodos de alto rendimiento.

Esta integración de métodos de alto rendimiento entre sí proporciona una plataforma que es particularmente adecuada para la identificación y detección fiable de polimorfismos en muestras de ácido nucleico sumamente complejas en las que la identificación convencional y el mapeo de polimorfismos serían laboriosos y requerirían mucho tiempo.

Una de las cosas que los presentes inventores han encontrado es una solución para la identificación de polimorfismos, preferiblemente polimorfismos de nucleótido único, pero asimismo para (micro) satélites y/o indels, en particular en genomas grandes. El método es único en su aplicabilidad a genomas grandes y pequeños parecidos, pero proporciona ventajas particulares para genomas grandes, en particular especies poliploidales.

Para identificar SNP (y posteriormente detectar los SNP identificados) , hay varias posibilidades disponibles en la técnica. En una primera opción, puede secuenciarse el genoma completo, y esto puede hacerse así para varios individuos. Esto es principalmente un ejercicio teórico, ya que esto es engorroso y caro y, a pesar del rápido desarrollo de la tecnología, simplemente no es viable hacerlo para cada organismo, especialmente los que tienen genomas más grandes. Una segunda opción es usar la información de secuencia disponible (fragmentada) , tal como bibliotecas de EST. Esto permite la generación de cebadores de PCR, la resecuenciación y la comparación entre individuos. De nuevo, esto requiere información de secuencia inicial que no está disponible o sólo en una cantidad limitada. Además, tienen que desarrollarse ensayos de PCR separados para cada región, lo que añade un enorme coste y tiempo de desarrollo.

La tercera opción es limitarse uno mismo a parte del genoma para cada individuo. La dificultad reside en que la parte proporcionada del genoma debe ser la misma para diferentes individuos con el fin de proporcionar un resultado comparable para lograr una identificación de SNP satisfactoria. Los presentes inventores han solucionado ahora este dilema mediante la integración de métodos sumamente reproducibles para seleccionar parte del genoma con secuenciación de alto rendimiento para la identificación de polimorfismos integrados con preparación de muestras y plataformas de identificación de alto rendimiento. La presente invención acelera el proceso de descubrimiento de polimorfismos y usa los mismos elementos en el proceso posterior para el aprovechamiento de los polimorfismos descubiertos para permitir un genotipado de alto rendimiento fiable y eficaz.

Las aplicaciones previstas adicionales del método de la presente invención incluye el examen de bibliotecas de microsatélites enriquecidas, realizar la obtención del perfil de transcrito de ADNc-AFLP (hibridación de tipo Northern digital) , secuenciación de genomas complejos, secuenciación de bibliotecas de EST (en ADNc completo o ADNc-AFLP) , descubrimiento de microARN (secuenciación de bibliotecas de insertos pequeñas) , secuenciación de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) (cóntigos) , enfoque de análisis de segregantes agrupados AFLP/ADNc-AFLP, detección de rutina de fragmentos de AFLP, por ejemplo para retrocruzamientos asistidos por marcador

(MABC) , etcétera.

Definiciones

En la siguiente descripción y ejemplos, se usan varios términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y sistemática de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se da a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan en el presente documento en su totalidad como referencia.

Polimorfismo: Polimorfismo se refiere a la presencia de dos o más variantes de una secuencia de nucleótidos en una población. Un polimorfismo puede comprender uno o más cambios de bases, una inserción, una repetición o una deleción. Un polimorfismo incluye por ejemplo una repetición de secuencia simple (SSR) y un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , que es una variación, que se produce cuando se altera un único nucleótido: adenina (A) , timina (T) , citosina (C) o guanina (G) . Una variación debe producirse generalmente en al menos el 1% de la población para que se considere un SNP. Los SNP constituyen por ejemplo el 90% de todas las variaciones genéticas humanas, y se producen cada de 100 a 300 bases a lo largo del genoma humano. Dos de cada tres SNP sustituyen citosina (C) por timina (T) . Las variaciones en las secuencias de ADN de por ejemplo seres humanos o plantas pueden afectar a cómo soportan enfermedades, bacterias, virus, productos químicos, fármacos, etc.

Ácido nucleico: Un ácido nucleico según la presente invención puede incluir cualquier polímero u oligómero de bases de pirimidina y purina, preferiblemente citosina, timina y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (véase Albert

L. Lehninger, Principles of Biochemistr y , en 793-800 (Worth Pub. 1982) que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad para todos los fines) . La presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componente de ácido nucleico peptídico, y cualquier variante química de los mismos, tales como formas metiladas, hidroximetiladas o glicosiladas de estas bases, y similares. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en composición, y pueden aislarse de fuentes que se producen de manera natural o pueden producirse de manera sintética o artificial. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir permanente o transitoriamente en forma mono o bicatenaria, incluyendo homodúplex, heterodúplex y estados híbridos.

Reducción de la complejidad: El término reducción de la complejidad se usa para indicar un método en el que se reduce la complejidad de una muestra de ácido nucleico, tal como ADN genómico, mediante la generación de un subconjunto de la muestra. Este subconjunto puede ser representativo de la muestra completa (es decir, compleja) y es preferiblemente un subconjunto reproducible. Reproducible significa en este contexto que cuando se reduce la complejidad de la misma muestra usando el mismo método, se obtiene el mismo subconjunto o al menos uno comparable. El método usado para la reducción de la... [Seguir leyendo]

1. Método para identificar uno o más polimorfismos en muestras de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una pluralidad de muestras de ácido nucleico de interés;

b) realizar una reducción de la complejidad en cada una de las muestras para proporcionar una pluralidad de bibliotecas de muestras de ácido nucleico,

c) ligar adaptadores a las muestras de ácido nucleico de complejidad reducida en las bibliotecas, usando un adaptador que porta una proyección 3’-T;

d) secuenciar al menos una parte de las bibliotecas; 15 e) alinear las secuencias de cada muestra obtenida en la etapa d) ;

f) determinar uno o más polimorfismos entre la pluralidad de muestras de ácido nucleico en la alineación de la etapa e) ;

g) opcionalmente, examinar un ácido nucleico de muestra de prueba de interés para identificar la presencia, ausencia o cantidad del uno o más polimorfismos determinados en la etapa f) usando sondas de detección.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico de muestra de prueba es una muestra de

ácido nucleico de complejidad reducida que se ha obtenido usando la reducción de la complejidad usada en la etapa b) .

3. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende además la etapa de etiquetar la

biblioteca para obtener una biblioteca etiquetada. 30

4. Método según la reivindicación 3, en el que la etiqueta se proporciona en el adaptador y/o el cebador.

5. Método según la reivindicación 3, en el que la etiqueta es una secuencia identificadora.

35 6. Método según la reivindicación 4, en el que al menos uno de los cebadores está fosforilado.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la secuenciación comprende secuenciar sobre un soporte sólido.

40 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el examen se realiza mediante inmovilización de las sondas diseñadas en la etapa g) según la reivindicación 1 sobre una matriz, seguido por la puesta en contacto de la matriz que comprende sondas con una biblioteca de prueba en condiciones de hibridación.

45 9. Uso del método según las reivindicaciones 1-8 para examinar bibliotecas de microsatélites enriquecidas, realizar la obtención del perfil de transcrito de ADNc-AFLP (hibridación de tipo Northern digital) , secuenciación de genomas complejos, secuenciación de bibliotecas de etiquetas de secuencia expresada (en ADNc completo o ADNc-AFLP) , descubrimiento de microARN (secuenciación de bibliotecas de insertos pequeñas) , secuenciación de cromosomas artificiales bacterianos (cóntigos) , enfoque de análisis de

50 segregantes agrupados en combinación con AFLP/ADNc-AFLP, detección de rutina de fragmentos AFLP (retrocruzamientos asistidos por marcador) .

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