Ésteres de acridinio estables con emisión de luz rápida.

Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida,

hidrolíticamente estable que comprende la estructura de fórmula I:

en la que Q se selecciona independientemente cada vez que aparece de un enlace, -O-, -S- o -N (R*) -; en la que R* se selecciona independientemente cada vez que aparece de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquil-arilo o aril-alquilo de cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos y combinaciones de los mismos, que contienen opcionalmente desde uno hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre, halógeno, y combinaciones de los mismos; con la condición de que al menos una Q debe ser -O-, -S- o -N (R*) -; en la que R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contiene hasta heteroátomos.

Ésteres de acridinio estables con emisión de luz rápida

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a ésteres de acridinio quimioluminiscentes útiles como marcadores en inmunoensayos y similares. Los ésteres de acridinio quimioluminiscentes son hidrolíticamente estables y de emisión de luz rápida.

Antecedentes de la invención

Los compuestos de acridinio quimioluminiscentes son marcadores extremadamente útiles que se han usado ampliamente en inmunoensayos y ensayos de ácidos nucleicos. Una revisión reciente, Pringle, M. J., Journal of Clinical Ligand Assay vol. 22, págs. 105-122 (1999) resume desarrollos pasados y actuales en esta clase de compuestos quimioluminiscentes.

El trabajo fundamental realizado por McCapra, F. et al., Tetrahedron Lett. vol. 43, págs. 3167-3172 (1964) y Rahut et al. J. Org. Chem vol. 301, págs. 3587-3592. (1965) dio a conocer que la quimioluminiscencia a partir de de ésteres fenílicos de sales de acridinio podría desencadenarse mediante peróxido alcalino. Desde estos estudios iniciales, ha aumentado el interés en los compuestos de acridinio debido a su utilidad como marcadores quimioluminiscentes. Simpson, J.S.A. et al., Nature vol. 279, págs. 646-647 (1979) dieron a conocer la aplicación del éster de acridinio, bromuro de 9-carboxifenil-N-metilacridinio, en un inmunoensayo. Este éster de acridinio es bastante inestable debido a la hidrólisis del enlace éster entre el anillo de acridinio y el fenol, limitando de ese modo su utilidad comercial a menos que se tomen precauciones especiales para proteger el enlace éster de la hidrólisis. Por ejemplo Arnold et al. en la patente estadounidense n.º 4.950.613 han demostrado que la estabilidad hidrolítica de los ésteres de acridinio inestables puede paliarse un poco con aditivos.

Se han descrito diferente estrategias para aumentar la estabilidad hidrolítica de los compuestos de acridinio alterando sus estructuras. Law et al., Journal of Bioluminiscence and Chemiluminiscence, vol. 4, págs. 88-89 (1989) notificaron que los fenoles que contienen dos grupos metilo flanqueando el grupo fenólico proporcionaban ésteres de acridinio que son más resistentes a la hidrólisis. Se encontró que el éster de acridinio DMAE-NHS [10-metilacridinio9-carboxilato de 2’, 6’-dimetil-4’- (N-succinimidilooxicarbonil) fenilo] tenía la misma producción de luz que un éster de acridinio que carece de los dos grupos metilo, pero era significativamente más resistente a la hidrólisis. Las patentes estadounidenses n.os 4.918.192 y 5.110.932 describen DMAE y sus aplicaciones. La patente estadounidense n.º

5.656.426 concedida a Law et al. da a conocer una versión hidrófila de DMAE denominada éster de NSP-DMAE-NHS donde el grupo metilo en el nitrógeno del anillo de acridinio se sustituye con un grupo sulfopropilo. Natrajan et al. en la patente estadounidense n.º 6.664.043 B2 dieron a conocer derivados de NSP-DMAE con modificadores hidrofílicos unidos al fenol.

Se ha descrito una clase diferente de compuestos de acridinio quimioluminiscentes estables por Kinkel et al., Journal of Bioluminiscence and Chemiluminiscence vol. 4, págs. 136-139 (1989) y Mattingly, Journal of Bioluminiscence and Chemiluminiscence vol. 6, págs. 107-114 (1991) y la patente estadounidense n.º 5.468.646. En esta clase de compuestos, el enlace de éster fenólico se sustituye por un resto de sulfonamida, que se notifica que confiere estabilidad hidrolítica sin comprometer la producción de luz. La estructura de DMAE-NHS y la estructura generalizada de una sulfonamida de acridinio se ilustran en la figura 1, junto con el sistema de numeración usado comúnmente para el éster de acridinio. Los restos de sulfonamida y fenol también se denominan comúnmente grupos salientes. También se han dado a conocer compuestos de acridinio quimioluminiscentes que contienen otros grupos salientes tales como oximas. Véase Renotte et al. Luminescence 2000, 15, 311-320.

Los compuestos de acridinio, en disolución acuosa, existen en equilibrio con aductos formados por la adición de agua a C-9 del anillo de acridinio. Este aducto se denomina comúnmente la pseudobase. El equilibrio acridiniopseudobase, que se ilustra en la figura 2, está fuertemente influido por el pH del medio acuoso. En disoluciones ácidas, la forma de acridinio se ve favorecida, mientras que en disolución básica la forma predominante es la pseudobase. El equilibrio acridinio-pseudobase también resulta afectado por la estructura del compuesto de acridinio. Los ésteres de acridinio que contienen grupos donadores de electrones en C-2 y/o C-7, reducen la electrofilicidad de C-9 y elevan el pH al que tiene lugar la transición de la forma de acridinio en la pseudobase. Las sulfonamidas de acridinio también son menos propensas a la formación de pseudobase que los ésteres de acridinio.

Quimioluminiscencia a partir de de los compuestos de acridinio normalmente se desencadena con peróxido de hidrógeno. Se cree que el mecanismo de emisión de luz implica la adición de peróxido de hidrógeno a C-9 del anillo de acridinio seguido por la escisión del grupo saliente y la formación concomitante de un compuesto intermedio de dioxetanona, de alta energía. Se supone que la rápida descomposición del compuesto intermedio de dioxetanona conduce a la formación de la acridona en un estado electrónicamente excitado. La emisión de luz se produce cuando la acridona en el estado excitado se invierte al estado de base. La formación del compuesto intermedio de dioxetanona no se ha demostrado de manera concluyente y un reciente estudio teórico postula que la escisión del

grupo saliente y la formación de la acridona en estado excitado pueden producirse simultáneamente. (Rak et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 3002-3008) .

En la práctica, la emisión de luz a partir de de compuestos de acridinio y sus conjugados usando peróxido de hidrógeno se lleva a cabo normalmente mediante un tratamiento inicial con ácido acuoso para efectuar la conversión completa de la pseudobase a la forma de acridinio, seguido por la adición de la base acuosa. El tratamiento ácido es necesario porque la pseudobase no puede reaccionar con peróxido de hidrógeno. La duración del tratamiento ácido y la fuerza del ácido que debe usarse dependen de la estructura del compuesto de acridinio. La adición de base ioniza la molécula de peróxido de hidrógeno para formar el ion hidroperóxido, que entonces se añade a C-9 del anillo de acridinio e inicia la emisión de luz. Por conveniencia, el peróxido de hidrógeno a menudo se añade junto con el ácido acuoso como un único reactivo. Normalmente, la emisión de luz a partir de del compuesto de acridinio o su conjugado se produce durante un periodo de tiempo de algunos segundos.

La cinética o velocidad de emisión de luz a partir de del compuesto de acridinio o su conjugado depende de varios factores. Tanto las concentraciones de peróxido de hidrógeno así como las de la base pueden afectar a la duración de emisión de luz. La presencia de tensioactivos también puede afectar a la velocidad de emisión de luz así como al rendimiento cuántico. Además, la estructura del compuesto de acridinio también tiene un profundo efecto sobre la cinética de emisión de luz. Aunque los sustituyentes en el anillo de acridinio, en el nitrógeno de acridinio y en el grupo saliente pueden afectar todos ellos a la cinética de emisión de luz, se ha notificado más ampliamente el efecto de diversas características estructurales del grupo saliente sobre la emisión de luz. Por ejemplo, Adamczyk et al. (Tetrahedron 1999, 55, 10899-10914) a partir de un estudio de diversas sulfonamidas de acridinio, han demostrado que la cinética de emisión de luz puede variarse por la variación estructural del grupo saliente de sulfonamida sin afectar a la cantidad total de luz emitida por estos compuestos. Estos investigadores concluyeron a partir de su estudio que los factores estéricos influían más en variar la velocidad de emisión de luz que el pKa del grupo saliente de sulfonamida. El aumento de la congestión estérica en el nitrógeno de sulfonamida de acridinio condujo a una emisión de luz lenta mientras que la liberación de tal impedimento estérico aceleró la emisión de luz.

Nelson et al. (Biochemistr y 1996, 35, 8429-8438) notificaron un estudio similar sobre ésteres fenílicos de acridinio. A partir de su estudio, los autores concluyeron que el pKa del grupo saliente de fenol tenía un efecto más significativo sobre la cinética de emisión de... [Seguir leyendo]

1. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable que comprende la estructura de fórmula I:

en la que Q se selecciona independientemente cada vez que aparece de un enlace, -O-, -S- o -N (R*) -; en la que R* se selecciona independientemente cada vez que aparece de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo,

arilo, alquil-arilo o aril-alquilo de cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos y combinaciones de los mismos, que contienen opcionalmente desde uno hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre, halógeno, y combinaciones de los mismos; con la condición de que al menos una Q debe ser -O-, -S- o -N (R*) -; en la que R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contiene hasta 20 heteroátomos.

2. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable según la reivindicación 1, en el que una Q representa -O- y la otra Q representa un enlace.

3. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable según la 20 reivindicación 2, en el que R* es metilo.

4. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable según la reivindicación 1, en el que ambos casos de Q representan -O-.

5. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable que comprende la estructura de fórmula II:

en la que R y R* se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo o aril-alquilo de cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos, y combinaciones de los mismos, que contienen opcionalmente desde uno hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre, halógeno, y combinaciones de los mismos; y en la que R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contiene hasta 20 heteroátomos.

6. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable según la reivindicación 5, en el que R es metilo.

7. Éster de acridinio quimioluminiscente de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable que comprende la 40 estructura de fórmula III:

en la que,

R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contiene hasta 20 heteroátomos;

R2 es un grupo en cualquiera de C1 a C4 y R3 es un grupo en cualquiera de C5 a C8;

en la que en los grupos R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contienen hasta 20 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno, azufre o halógeno;

X e Y se seleccionan independientemente cada vez que aparecen de un enlace, -O-, -S- o -N (R*) -; en la

que R* se selecciona independientemente cada vez que aparece de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquil-arilo o aril-alquilo de cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos, y combinaciones de los mismos, que contienen opcionalmente desde uno hasta 20 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre, halógeno, y combinaciones de los mismos; con la condición de que o bien X o Y o bien ambos deben ser -O-, -S- o -N (R*) -;

R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo o alquil-arilo que contienen hasta 20 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno, azufre o halógeno;

R6 y R7 se seleccionan independientemente de hidrógeno, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, aril-alquilo, alquil-arilo, alcoxilo (-OR) , alquiltiol (-SR) y -NR2 en los que R en el nitrógeno puede ser igual o diferente y es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aril-alquilo o alquil-arilo que contiene hasta 20 heteroátomos;

R8 es un grupo intercambiable con R6 y R7 y es un grupo -R9-R10;

R9 representa un enlace o un grupo alquilo, arilo, aril-alquilo o alquil-arilo de cadena lineal o ramificada, sustituido o no sustituido que contiene hasta 20 heteroátomos;

R10 es un grupo funcional electrófilo o nucleófilo seleccionado de los siguientes:

(a) proporcionar un conjugado que comprende: (i) una molécula de unión específica para un analito; y (ii) un éster de acridinio de emisión de luz rápida, hidrolíticamente estable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17;

(b) proporcionar un soporte sólido sobre el que está inmovilizada una segunda molécula de unión específica para dicho analito;

(c) mezclar el conjugado, la fase sólida y una muestra que se sospecha que contiene el analito para formar

un complejo de unión; 10

(d) separar el complejo de unión capturado sobre el soporte sólido,

(e) desencadenar quimioluminiscencia del complejo de unión de la etapa (d) añadiendo reactivos

desencadenantes de quimioluminiscencia; 15

(f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro, y

(g) detectar la presencia o calcular la concentración del analito comparando la cantidad de luz emitida a

partir de la mezcla de reacción con una curva de respuesta a la dosis patrón que relaciona la cantidad de 20 luz emitida con una concentración conocida del analito.

19. Ensayo para la detección o cuantificación de un analito que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un conjugado de un analito con un éster de acridinio de emisión de luz rápida, 25 hidrolíticamente estable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17;

(b) proporcionar un soporte sólido inmovilizado con una molécula de unión específica para el analito;

(c) mezclar el conjugado, el soporte sólido y una muestra que se sospecha que contiene el analito para 30 formar un complejo de unión;

(d) separar el complejo de unión capturado sobre el soporte sólido;

(e) desencadenar la quimioluminiscencia del complejo de unión de la etapa (d) añadiendo reactivos 35 desencadenantes de quimioluminiscencia;

(f) medir la cantidad de luz con un luminómetro; y

(g) detectar la presencia o calcular la concentración del analito comparando la cantidad de luz emitida a

partir de la mezcla de reacción con una curva de respuesta a la dosis patrón que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

20. Conjugado de los ésteres de acridinio según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17, con un analito.

45 21. Conjugado según la reivindicación 20, en el que el analito es un analito de molécula pequeña seleccionado de esteroides, vitaminas, hormonas, fármacos terapéuticos y péptidos pequeños.

22. Conjugado según la reivindicación 20, en el que el analito es un analito macromolecular seleccionado de

proteínas, ácidos nucleicos, oligosacáridos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, células, virus y 50 polímeros sintéticos.