Estabilización de enzima en sensores electroquímicos.

Composición para la formación de un electrodo, cuya composición comprende un componente eléctricamente conductor que tiene una enzima específica del analito unida de forma covalente al mismo,

caracterizada porque la composición comprende, además, como mínimo, un componente eléctricamente no conductor o semiconductor, que estabiliza la enzima específica del analito al convertir sustancias químicas que provocan la descomposición de la enzima, de manera que dicho componente estabilizador de la enzima eléctricamente no conductor o semiconductor es seleccionado entre el grupo que consiste en un óxido de Mn, en particular, Mn02, Mn304 o Mn50e, CuO y ZnO.

Estabilización de enzima en sensores electroquímicos

La presente invención se refiere a una composición para la formación de un electrodo, a un sensor electroquímico que lo comprende, ya un procedimiento para la determinación de un analito utilizando el sensor electroquímico.

Los sistemas de medición para análisis bioquímico son componentes importantes de procedimientos analíticos clínicamente relevantes. Esto se refiere principalmente a la medición de analitos que pueden ser determinados directa o indirectamente con ayuda de enzimas. La determinación de la concentración de parámetros clínicamente útiles se lleva a cabo generalmente utilizando sistemas analíticos in vitre. No obstante, cuando se determinan analitos que muestran un cambio significativo de su concentración a lo largo del día, un análisis in vitro no es apropiado debido a la resolución temporal limitada y a las dificultades que se encuentran con el muestreo.

En este caso, los biosensores, es decir, sistemas de medición dotados de componentes biológicos, que permiten una medición repetida del analito de manera continua o discontinua, y que se pueden utilizar ex vivo, así como in vivo, se han mostrado especialmente adecuados para la medición de analitos. Los biosensores ex vivo se utilizan de manera típica en celdas de flujo pasante, mientras que los biosensores in vivo pueden ser implantados, por ejemplo, en tejidos grasos subcutáneos. A este respecto, se distingue entre implantes transcutáneos que son introducidos solamente en los tejidos durante un corto periodo de tiempo y que se encuentran en contacto directo con un dispositivo de medición situado sobre la piel, e implantes completos que son insertados quirúrgicamente en el tejido junto con un dispositivo de medición.

Los biosensores electroquímicos que comprenden una enzima como componente biológico contienen la enzima en o sobre el electrodo de trabajo, en cuyo caso, por ejemplo, el analito puede servir como substrato para la enzima y se puede alterar fisicoquímicamente (por ejemplo, oxidándose) con ayuda de esta enzima. La medición eléctrica, utilizando una señal generada por el flujo de electrones liberado durante la conversión del analito sobre el electrodo de trabajo, se correlaciona con la concentración del analito medido, de manera tal que la señal de medición eléctrica puede ser utilizada para determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra.

En la práctica, un electrodo de trabajo debe cumplir una serie de exigencias para que sea adecuado en sensores electroquímicos:

El electrodo de trabajo debe tener una baja resistencia de contacto y, por lo tanto, debe ser altamente conductor. El electrodo de trabajo no debe comprender componentes que se conviertan electroquímicamente en el voltaje de polarización seleccionado. Esto se puede conseguir por la elección adecuada de componentes de unión y cargas. El área superficial electroquímicamente activa del electrodo de trabajo se tiene que mantener constante a lo largo de todo el periodo de funcionamiento. Para este objetivo, se tiene que evitar la reducción del área superficial debido a la adsorción de componentes del fluido circundante. Esto es afectado en general al aplicar uno o varios recubrimientos de polímero que son altamente biocompatibles. La reacción electroquímica del producto de conversión de la reacción enzimática se debe llevar a cabo a un sobrepotencial reducido a efectos de minimizar el voltaje de descomposición y, por lo tanto, posibilitar una conversión específica del parámetro. Para este objetivo, se debe disponer una transferencia rápida de electrones desde el grupo protésico de la enzima al electrodo derivado. El electrodo de trabajo debe comprender una cantidad suficiente de la enzima específica del analito teniendo actividad suficiente y constante para garantizar que la reacción enzimática superpuesta a la conversión electroquímica no está limitada por la actividad enzimática disponible, sino por la cantidad disponible de analito. En otras palabras, la sensibilidad tiene que ser mantenida a lo largo de todo el periodo de funcionamiento. La difusión de la enzima desde el electrodo de trabajo a los tejidos circundantes se tiene que evitar, también por la razón de una posible toxicidad de la enzima. Finalmente, se tiene que disponer para que la actividad enzimática no se reduzca por debajo de un límite predeterminado durante el almacenamiento.

Se conocen una serie de composiciones de electrodos para minimizar los sobrepotenciales. En lo que respecta a H20 2, se puede reducir el potencial de oxidación, por ejemplo, en 450mV utilizando fibras de carbono recubiertas con rodio y glucosa oxidasa, en comparación con fibras de carbono con recubrimiento de glucosa oxidasa sola [Wang y otros, Analylical Chemistr y (1992) , 64, 456-459]. Un procedimiento que es más simple de realizar se describe en el documento EP O603 154 A2, cuyo documento da a conocer un compuesto electrodo producido por mezcla completa de óxidos y/o hidróxidos de elementos del 4rto periodo de la tabla periódica con grafito y un compuesto de unión, conduciendo a una reducción de sobrevoltaje de la oxidación anódica de H202 en> 200 mV.

Además de óxidos de metales eléctricamente no conductores y/o semiconductores introducidos de modo general en compuestos de electrodos, se conocen electrocatalizadores eléctricamente conductores, tales como nanotubos de carbono, los cuales, debido a sus pequeñas dimensiones, pueden ser dispuestos en las proximidades del centro protésico de la enzima, tienen una elevada conductividad eléctrica y posibilitan una transferencia eficiente de electrones, [Wang y otros, Analyst (2003) , 128, 1382-1385; Wang y otros, Analyst (2004) , 129, 1-2; Wang y otros, Analylica Chimica Acta (2005) , 539, 209-213; Shobha Jeykumari y otros, Biosensors and Bioelectronics (2008) , 23, 1404-1411]. Debido a su gran área superficial, pequeñas cantidades de nanotubos son suficientes para obtener una reducción del potencial de descomposición rUS 2006/0021881 A1].

Se conocen diferentes medidas en esta técnica para conseguir una actividad enzimática constante. Una posibilidad para evitar difusión de la enzima de la superficie en el electrodo de trabajo hacia el entorno consiste en dotar al electrodo de trabajo de un recubrimiento adecuado, por ejemplo, una membrana de recubrimiento. No obstante, la utilización de estos recubrimientos en sensores electroquímicos se asocia a ciertos problemas, tales como la necesidad de depositar membranas libres de microorificios ("pinhole") . En segundo lugar, la membrana de recubrimiento debe ser depositada con un grosor de la capa altamente reproducible para sistemas limitados a transferencia en masa. Esta exigencia representa una extensa restricción de posibles recubrimientos, dado que la realización de capas muy delgadas que muestren una capacidad barrera suficientemente elevada a la transferencia en masa, es difícil de realizar.

Además, los sensores electroquímicos que son utilizados para determinar diferentes analitos, deben contener también usualmente diferentes membranas de recubrimiento a efectos de proporcionar diferentes tasas de transferencia en masa del sustrato y co-sustrato al electrodo. Al mismo tiempo, se debe asegurar que las membranas de recubrimiento son altamente biocompatibles para aplicaciones in vivo. Dado que, incluso los menores defectos de la membrana son suficientes para dar el resultado de transferencia de la enzima desde el electrodo al entorno, es necesaria una enorme cantidad de control de calidad, especialmente en el caso de biosensores in vivo, con el resultado de exigencias técnicas considerables y costes de producción incrementados.

De manera alternativa, la extensión de la transferencia de enzima se puede reducir inmovilizando la enzima en la matriz del electrodo del electrodo de trabajo, lo que ha conducido a una búsqueda intensa de procedimientos de inmovilización adecuados para enzimas en biosensores electroquímicos. En la práctica, la enzima puede ser, o bien acoplada a uno o varios componentes de pasta de forma químicamente covalente, o se puede insertar físicamente en un compuesto, de manera que la enzima queda unida por adsorción a uno o varios componentes de pasta y/o incorporada en los mismos.

En lo que respecta a la inmovilización de adsorción, Rege y otros, [Nano Letlers (2003) , 3, 829-832] dan a conocer un compuesto de electrodo que comprende nanotubos de carbón o de pared única (SWCNT) y/o grafito como cargas conductores y PMMA como material de unión, de manera que se retiene... [Seguir leyendo]

1. Composición para la formación de un electrodo, cuya composición comprende un componente eléctricamente conductor que tiene una enzima específica del analito unida de forma covalente al mismo, caracterizada porq ue la composición comprende, además, como mínimo, un componente eléctricamente no conductor o semiconductor, que estabiliza la enzima específica del analito al convertir sustancias químicas que provocan la descomposición de la enzima, de manera que dicho componente estabilizador de la enzima eléctricamente no conductor o semiconductor es seleccionado entre el grupo que consiste en un óxido de Mn, en particular, Mn02, Mn304 o Mn50e, CuO y ZnO.

2. Composición, según la reivindicación 1, caracterizado porq ue el componente eléctricamente conductor es un catalizador de descomposición de H202.

3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porq ue el componente eléctricamente conductor es seleccionado del grupo que consiste en carbón activado, negro de carbón, grafito, nanotubos carbonosos, paladio, platino, e hidróxidos de óxido de hierro, en particular, seleccionados del grupo que consiste en grafito y nanotubos carbonosos.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porq ue la enzima es una oxidasa, en particular una glucosa oxidasa.

5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porq ue comprende, además, la enzima específica del analito fijada de forma covalente al componente estabilizante de la enzima eléctricamente no conductor o semiconductor.

6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porq ue el componente eléctricamente conductor y/o el componente estabilizante de la enzima eléctricamente no conductor

o semiconductor está dispuesto en forma de nanopartículas.

7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porq ue comprende además, como mínimo, un material de unión seleccionado entre el grupo que consiste en hidrocarburos fluorados, policarbonatos, poliisopreno, poliuretanos, resinas acrílicas, resinas de polivinilo y siliconas, en particular seleccionadas del grupo que consiste en poliuretanos, resinas acrílicas y resinas polivinílicas.

8. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porq ue el componente eléctricamente conductor y/o el componente estabilizante de la enzima eléctricamente no conductor

o semiconductor, es dispersado de manera homogénea en la composición.

9. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porq ue la enzima tiene una actividad residual de, como mínimo, 90%, después de almacenamiento de la composición durante un mínimo de 4 semanas, preferentemente un mínimo de 12 semanas, más preferentemente, como mínimo 28 semanas a una temperatura de 4°C, basada en la actividad total de la enzima antes del almacenamiento.

10. Sensor electroquímico para determinar un analito, cuyo sensor comprende, como mínimo, un electrodo de trabajo y, como mínimo, un electrodo de referencia, caracterizado porq ue el electrodo de trabajo comprende la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Sensor electroquímico, según la reivindicación 10, caracterizado porq ue comprende un recubrimiento biocompatible que recubre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia.

12. Sensor electroquímico, según la reivindicación 10 ú 11, para determinar un analito en un fluido corporal, en particular en sangre entera, plasma, suero o fluido de tejidos extracelulares.

13. Sensor electroquímico, según la reivindicación 10 ú 11, para determinar un analito seleccionado entre el grupo que consiste en ácido málico, alcohol, amoniaco, ácido ascórbico, colesterol, cisteína, glucosa, glutatión, glicerol, urea, 3-hidroxibutirato, ácido láctico.

5. nucleotidasa, péptidos, piruvato, salicilato y triglicéridos, en particular glucosa.

14. Procedimiento para la determinación de un analito que comprende las siguientes etapas:

(a) establecer contacto de una muestra que contiene el analito con un sensor electroquímico, según la

reivindicación 10 ú 11, y 10 (b) determinar la presencia y/o cantidad del analito.