ENDOQUITINASA ÁCIDA ACTIVA A BAJAS TEMPERATURAS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USOS.
Endoquitinasa ácida activa a bajas temperaturas, procedimiento de obtención y usos.
Endoquitinasa obtenida a partir de la pulpa de especies de la familia Annonaceae, catalíticamente activa a bajas temperaturas, con capacidad antifúngica y estable a pH ácido, procedimiento de obtención, y usos.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930266.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: ESCRIBANO GARAIZABAL,MARIA ISABEL, MERODIO MORENO,CARMEN, GOÑI RAMOS,OSCAR.
Fecha de Solicitud: 4 de Junio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 16 de Enero de 2012.
Clasificación PCT:
- C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
- C12N9/24 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
PDF original: ES-2352924_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Endoquitinasa ácida activa a bajas temperaturas, procedimiento de obtención y usos.
La presente invención se encuentra dentro de la enzimología, la biotecnología, la biorremediación, biocatálisis y el biocontrol de hongos fitopatógenos, y tiene aplicación en la industria agroalimentaria, energética, medioambiental, farmacéutica y médica. Se refiere a una nueva proteína endoquitinasa catalíticamente activa a bajas temperaturas, con capacidad antifúngica y estable a pH ácido. Se refiere también a un método para el aislamiento, producción y purificación de dicha proteína y su uso en procesos de degradación o modificación de materiales que contienen quitina en condiciones que requieran bajas temperaturas, siendo fácilmente inactivada a temperaturas moderadas o pH alcalinos.
Estado de la técnica anterior
La quitina, polisacárido lineal formado por unidades de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) unidas por enlaces β (1-4) glucosídicos, es el polímero más abundante que contiene nitrógeno y el segundo biopolímero más abundante de la Tierra, siendo una fuente de nitrógeno esencial para el crecimiento y supervivencia de ecosistemas marinos y terrestres. Este biopolímero natural es el constituyente principal de la pared celular de los hongos, del exoesqueleto de artrópodos, y del caparazón de algunos otros animales como crustáceos y nematodos.
Industrialmente, la quitina es purificada a partir de desechos de crustáceos marinos. Posteriormente es despolimerizada y/o desacetilada, dando lugar a quitosano, oligosacáridos de quitina/quitosano y N-acetil-D-glucosamina/D-glucosamina. La conversión enzimática de quitina es una alternativa respetuosa con el medioambiente al ser sustitutiva de los métodos convencionales que usan productos químicos para su despolimerización, siendo utilizada en procesos de biocatálisis (enzima soluble o inmovilizada), biorremediación y biocontrol (hongos fitopatógenos) y para su aplicación en la industria agroalimentaria (alimentos marinos y conservación de alimentos sanos) y médica.
Las endoquitinasas (EC 3.2.1.14, según la clasificación EC-Enzyme Commission numbers-) están presentes en un amplio rango de organismos, entre los que se encuentran los virus, bacterias, hongos, insectos, plantas superiores y animales. Recientemente se ha descrito actividad endoquitinasa en el suero humano. Esta clase de quitinasas hidrolizan de un modo aleatorio la cadena hidrocarbonada de la quitina, generando oligosacáridos de quitina de tamaño variable. Las enzimas endoquitinolíticas desempeñan funciones muy diversas, dependiendo del organismo. Así, están implicadas en la resistencia de las plantas a hongos debido a su naturaleza inducible ante un estrés y su actividad antifúngica in vitro (siendo mayoritariamente las endoquitinasas las que muestran esta actividad). En hongos, además de su papel defensivo, presentan funciones autolíticas, nutricionales y morfogenéticas. En virus están involucradas en la patogénesis y en bacterias están relacionadas con la nutrición y el parasitismo.
Además de estas funcionalidades naturales, las endoquitinasas pueden ser utilizadas para la producción de quitooligosacáridos, los cuales actúan como agentes antibacterianos e immunopotenciadores. Incluso la N-acetil-D-glucosamina presenta actividad antiinflamatoria, siendo efectiva en el tratamiento de afecciones gastrointestinales. Gracias a sus conocidas propiedades antifúngicas in vitro e in vivo, las endoquitinasas pueden ser también aplicadas en la agricultura para el biocontrol de hongos fitopatógenos u otros patógenos vegetales y como biopesticidas (Patil et al., 2000. Enzyme and Microbial Technology, 26, 473-483; Kasprzewska 2003. Biology Letters, 8, 809-824; Dahiya et al., 2006. Applied Microbiology and Biotechnology, 71, 733-782).
Por sus útiles aplicaciones biotecnológicas las quitinasas están ganando importancia en diferentes industrias, como la bioquímica, química o alimentaria. Sin embargo, el éxito en el empleo de estas enzimas hidrolíticas depende del suministro de preparaciones altamente activas y estables en diferentes condiciones de pH y temperatura. Así, una alta estabilidad está generalmente considerada como una ventaja en una determinada etapa industrial puesto que reduce la cantidad de enzima mínima catalíticamente útil en unas condiciones definidas. Con el fin de aumentar la estabilidad de las quitinasas se han empleado múltiples y diferentes estrategias tales como: mutaciones, modificación química del centro activo, introducción de puentes disulfuro, inmovilizaciones de las enzimas, estabilización entrópica, cambio de condiciones del pH y el uso de diferentes sales. Conocer los datos termodinámicos de la estabilidad de las enzimas y de su reacción de catálisis es esencial para predecir el ámbito de la reacción y el estado de cualquier etapa del proceso en el cual la reacción se produce.
Para conocer con detalle el efecto de la temperatura sobre la actividad catalítica de una enzima es esencial determinar dos factores: su actividad residual y el valor de la energía libre de Gibbs de activación catalítica (ΔG*) a una temperatura definida. Recientemente ha cobrado interés el estudio de un nuevo grupo de enzimas llamadas "enzimas adaptadas al frío" (cold-adapted enzymes) que, comparadas con sus homologas mesofilas y termofilas, muestran a bajas temperaturas (0-20ºC) mayores constantes catalíticas (kcat) y eficiencias fisiológicas (kcat/Km), y menores valores de la energía de activación (Ea). Otra peculiaridad que tienen es que se encuentran en general, si no siempre, asociadas a una mayor termolabilidad. Este aspecto permite el control de la reacción enzimática a través de la inactivación por calor, mediante la aplicación de temperaturas moderadas (50-60ºC). Todos estos aspectos sumados a sus inherentes propiedades bioquímicas permiten que este nuevo grupo de enzimas ofrezcan un considerable espectro de aplicación en diferentes procesos industriales a bajas temperaturas. Dentro de éstos destacan la elaboración de detergentes, la síntesis de productos químicos o farmacéuticos de alta pureza, en la industria alimentaria o en la biorremediación (Gerday et al., 2000. Trends in Biotechnology, 18, 103-107).
A pesar de su potencial aplicación biotecnológica, muy pocas enzimas activas a baja temperatura están siendo utilizadas comercialmente, quizá debido al alto riesgo y coste asociado a la obtención de estas enzimas. Entre otras, dos lipasas, una lisozima, una celulasa, una endoxilanasa y varias proteasas (Cavicchioli et al., 2002. Current Opinion in Biotechnology, 13, 253-261. Joseph et al., 2008. Biotechnology Advances, 26 (5), 457-470).
En relación con las proteasas adaptadas a bajas temperaturas, existe un documento que describe una proteasa alcalina para su uso como detergente procedente de un actinomiceto (WO 9,743,406; 1996) y dos proteasas procedentes de bacterias CP-58 (WO 9,730,172; 1997) y CP-70 (U.S. 6,200,793; 1998).Con respecto a las lipasas activas a bajas temperaturas, hay dos patentes registradas acerca de esta clase de enzima y sus variantes procedentes de Candida Antarctica (U.S. 6,020,180; 2000 y U.S. 6,074,863; 2000). Por último dentro de las familias de glicosil-hidrolasas existen dos documentos relacionados: uno de ellos es referente a una β-galactosidasa activa por debajo de 8ºC procedente de una bacteria Antártica (Patente U.S. 6,727,084; 2001) y otro a una endoxilanasa aislada de un microorganismo psicrofílico (WO 2005/087916). Este tipo de proteínas han sido producidas, hasta ahora, por microorganismos adaptados al frío u organismos psicrofílicos, capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5ºC, encontrándose su temperatura óptima de desarrollo entre 4ºC y 15ºC. Las estrategias utilizadas para la obtención de este tipo de enzimas han pasado por el clonaje del gen que las codifica y su expresión recombinante en E. coli a bajas temperaturas.
El principal inconveniente derivado del uso de nuevas proteínas en alimentos refrigerados está relacionado con el origen de las mismas. Los requerimientos de seguridad y de aceptación por el consumidor apuntan hacia productos naturales u orgánicos, en contra de aditivos y productos químicos o materiales modificados genéticamente. Una primera aproximación para el reemplazo de estos conservantes químicos podría ser la utilización directa de microorganismos psicrófilos en los alimentos,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Proteína endoquitinasa monomérica aislada de clase I ácida y extracelular (clase Ib), derivada de la pulpa de especies de la familia Annonaceae, que presenta alta actividad catalítica a bajas temperaturas y capacidad antifúngica in vitro frente a Botrytis cinerea, con la capacidad de hidrolizar tanto sustratos poliméricos como oligoméricos solubles, caracterizada por las siguientes propiedades fisicoquímicas:
2. Proteína endoquitinasa monomérica según la reivindicación anterior, que presenta frente a sustratos poliméricos solubles, (CM-Chitin-RBV), un valor de la constante de afinidad (Km) de 0,16 y 0,18 mg•ml-1, para la constante catalítica (kcat) un valor de entre 1,19•105 y 1,21•105 ΔA550•min-1•mM-1, y un valor de la eficiencia catalítica (kcat/Km) de entre 6,5•105 y 7,22•105 ΔA550•ml•min-1•mM-1•mg-1.
3. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que presenta frente al oligómero soluble 4-MU-β-(GlcNAc)3, un valor para la constante catalítica (kcat) de entre 9,56 y 10,58 s-1, un valor para la constante de afinidad (Km) de entre 0,19 y 0,23 mM y una eficiencia catalítica (kcat/Km) de entre 44,7 y 51,42 s-1•mM-1.
4. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, estable en un rango de pH de entre 2,5 y 7,5.
5. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que mantiene más de un 40% de actividad a una temperatura de 5ºC.
6. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que presenta una temperatura óptima de entre 33 y 37ºC.
7. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que presenta un valor de Ea de entre 6,15 y 6,97 kJ•mol-1 entre 5 y 37ºC, de entalpía de activación (ΔH*) de entre 3,73 y 4,23 a 37ºC y de entre 4,04 y 4,46 a 5ºC expresados en kJ•mol1, de entropía de activación (ΔS*) (de entre -138 y -131,2 a 37ºC y de entre -145,6 y -128,4 a 5ºC expresados en J•mol-1•K-1) y de energía libre de Gibbs (ΔG*) (de entre 26 y 29,2 a 37ºC y de entre 31,4 y 36,2 a 5ºC expresados en kJ•mol-1).
8. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, aislada de la especie Annona cherimola Mill.
9. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que se encuentra en forma soluble.
10. Proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que se encuentra inmovilizada.
11. Composición que comprende una proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. Procedimiento de aislamiento y purificación de la proteína endoquitinasa monomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende:
13. Procedimiento de aislamiento y purificación según la reivindicación 12, donde la recuperación de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 es de entre el 4,85 y el 7,85%.
14. Procedimiento de aislamiento y purificación según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde el factor de purificación de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 es de entre 42 y 66.
15. Procedimiento de aislamiento y purificación según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que extracción de las proteínas del material vegetal del paso (b) se realiza a un pH comprendido entre 4 y 6.
16. Procedimiento de aislamiento y purificación según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en la que extracción de las proteínas del material vegetal del paso (b) se realiza a una temperatura de entre 3 y 5ºC.
17. Procedimiento de aislamiento y purificación según cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en la que en el paso (b) se añaden agentes antioxidantes.
18. Procedimiento de aislamiento y purificación según cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en la que en el paso (b) se añaden agentes quelantes de cationes.
19. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o de la composición según la reivindicación 11, como biocatalizador en reacciones químicas.
20. Uso de una proteína o de una composición según la reivindicación anterior, donde la reacción transcurre a temperaturas de entre 0 y 50ºC.
21. Uso de una proteína o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde la reacción transcurre a temperaturas de entre 0 y 10ºC.
22. Uso de una proteína o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde la reacción transcurre a un pH de entre 2,5 y 7,5.
23. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o de la composición según la reivindicación 11, para inhibir el crecimiento de un hongo.
24. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o de la composición según la reivindicación 11, para la elaboración de un medicamento.
25. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o de la composición según la reivindicación 11, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de micosis.
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