PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE ARN A PARTIR DE ESPECÍMENES DE TEJIDO FIJADOS CON FORMALINA E INCLUIDOS EN PARAFINA.

Procedimiento para el aislamiento de ARN a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina Apoyo gubernamental El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención en virtud el número de asignación R01 CA 71716 del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud. Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la purificación de ARN, ADN y proteínas de muestras de tejido biológico. Antecedentes La determinación de los niveles de expresión génica en los tejidos es de gran importancia para el diagnóstico exacto de enfermedades en seres humanos y se utiliza cada vez más para determinar el curso del tratamiento de un paciente. Los procedimientos farmacogenómicos pueden identificar pacientes propensos a responder a un fármaco en particular y pueden abrir el camino a nuevos enfoques terapéuticos. Por ejemplo, la timidilato sintasa (TS) es una enzima integral en la biosíntesis de ADN en la que cataliza la metilación reductiva de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) a monofosfato de desoxitimidina (dTMP) y proporciona la única vía para la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina en la célula (Johnston et al., 1995). La timidilato sintasa es una diana para los fármacos quimioterapéuticos, más comúnmente el agente antifolato 5-fluorouracilo (5- FU). Como el agente más efectivo para el tratamiento de los cánceres de colon, cabeza y cuello y mama, la acción primaria del 5-FU es inhibir la actividad de TS, lo que resulta en una disminución de los niveles intracelulares de timina y en consecuencia provoca la muerte celular. Se ha informado una variación considerable en la expresión de TS entre especímenes clínicos tumorales de tumores primarios (Johnston et al. 1995; Lenz et al. 1995) y metástasis (Farrugia et al. 1997; Leichmann et al. 1997). En el cáncer colorrectal, por ejemplo, la tasa de expresión de TS en el tejido tumoral con respecto al tejido de la mucosa gastrointestinal normal ha abarcado de 2 a 10 (Ardalan y Zang, 1996). La timidilato sintasa también es conocida por tener importancia clínica en el desarrollo de resistencia tumoral, como se ha demostrado mediante estudios que han mostrado inducción aguda de la proteína de TS y aumento en los niveles de enzimas TS en células neoplásicas después de la exposición a 5-FU (Spears et al., 1982, Swain y col 1989). La capacidad de un tumor de sobreexpresar TS en forma aguda en respuesta a agentes citotóxicos como 5- FU puede desempeñar un rol en el desarrollo de resistencia a fluorouracilo. Estudios anteriores han mostrado que los niveles de proteína TS se correlacionan directamente con la efectividad de la terapia con 5-FU, que existe una correlación directa entre la proteína y la expresión de ARN (Jackman et al., 1985) y que la expresión de TS es un marcador pronóstico potente en el cáncer colorrectal y de mama (Jackman et al. 1985; Horikoshi et al. 1992). En la enfermedad metastásica avanzada, se ha demostrado que el ARNm de TS elevado, cuantificado por RT-PCR, y la expresión de proteína de TS elevada predicen mala respuesta a la terapia basada en fluoropirimidinas para los cánceres colorrectal (Johnston et al., 1995, Farrugia et al., 1997, Leichman et al., 1997), gástrico (Lenz et al., 1995, Alexander et al., 1995), y de cabeza y cuello (Johnston et al., 1997). Estuvo presente a menudo una considerable superposición entre respondedores y no respondedores en la categoría de TS baja, pero los pacientes con niveles de TS por encima de la mediana fueron en su mayoría no respondedores. El valor predictivo de la sobreexpresión de TS puede ser aún mayor si se combina con otras características moleculares como niveles de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) y expresión de timidina fosforilasa (TP), estado de error de replicación positivo (RER+) (Kitchens y Berger, 1997), y estado de p53 (Lenz et al., 1997). Los estudios realizados hasta la fecha que han evaluado la expresión de TS en tumores humanos sugieren que la capacidad para predecir la respuesta y el resultado basado en la expresión de TS en tumores humanos pueden brindar la oportunidad en el futuro de seleccionar a los pacientes más susceptibles de beneficiarse de la terapia dirigida a TS. Hasta ahora, los estudios de expresión génica tisular cuantitativa que incluyen los de expresión de TS se han limitado a la amplificación de ARN por transcriptasa reversa reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) a partir de tejido congelado. Sin embargo, la mayoría de las muestras patológicas no están preparadas como tejidos congelados, sino que habitualmente son fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) para permitir el análisis histológico y el almacenamiento para archivo. Los niveles de expresión génica pueden ser monitoreados semi- cuantitativamente e indirectamente en estas muestras fijadas e incluidas mediante el uso de tinción inmunohistoquímica para monitorear los niveles de expresión de proteínas. Debido a que las muestras incluidas en parafina están ampliamente disponibles, son necesarios procedimientos rápidos y confiables para el aislamiento de ácidos nucleicos, en especial de ARN, a partir de dichas muestras. 2 E06123097 01-12-2011   Existen un número de técnicas para la purificación de ARN de muestras biológicas, pero ninguna es fiable para el aislamiento de ARN de muestras FFPE. Por ejemplo, Chomczynski (Patente de EE.UU. Núm. 5.346.994) describe un procedimiento para la purificación de ARN de tejidos basado en una separación en fase líquida usando fenol e isotiocianato de guanidina. Una muestra biológica se homogeneiza en una solución acuosa de fenol e isotiocianato de guanidina y el homogeneizado de esta se mezcla con cloroformo. Después de la centrifugación, el homogeneizado se separa en una fase orgánica, una interfase y una fase acuosa. Las proteínas son secuestradas en la fase orgánica, el ADN en la interfase, y el ARN en la fase acuosa. El ARN puede ser precipitado de la fase acuosa. Este procedimiento no permite el aislamiento fiable de ARN de muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina. Otras técnicas conocidas para el aislamiento de ARN suelen utilizar sales de guanidina o extracción con fenol, como se describe por ejemplo en Sambrook, J. et al., (1989) en las pág. 7.3-7.24, y en Ausubel, F. M. et al., (1994) en las pág. 4.0.3-4.4.7. Sin embargo, ninguno de los procedimientos conocidos proporciona resultados cuantitativos reproducibles en el aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido incluidas en parafina. Las técnicas para el aislamiento de ARN a partir de tejidos incluidos en parafina son particularmente necesarias para el estudio de la expresión génica en tejidos tumorales. Los niveles de expresión de ciertos receptores o enzimas pueden indicar la probabilidad de éxito de un tratamiento en particular. Los estudios de expresión génica de TS verdaderamente cuantitativos se han limitado a RT-PCR a partir de tejido congelado, mientras que el monitoreo semi-cuantitativo de control de la expresión de proteína de TS en material patológico de archivo fijado en portaobjetos de vidrio ha estado disponible a través de la tinción inmunohistoquímica. Debido a las limitaciones en el aislamiento de ARN a partir de material patológico de archivo, no se dispone hasta el momento de técnicas cuantitativas para medir los niveles de expresión génica de estas muestras. Sumario Un aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento fiable para el aislamiento de ARN, ADN o proteínas de muestras de tejidos biológicos. La invención también proporciona procedimientos simples, eficientes y reproducibles para el aislamiento de ARN, ADN o proteínas de tejidos que han sido incluidos en parafina. La invención proporciona procedimientos de purificación de ARN a partir de una muestra de tejido biológico mediante el calentamiento de la muestra durante aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100ºC en una solución de una concentración efectiva de un agente caotrópico. En una realización, el agente caotrópico es un compuesto de guanidinio. El ARN se recupera a partir de dicha solución. Por ejemplo, la recuperación de ARN puede realizarse por extracción con cloroformo. En un procedimiento de la invención, el ARN es aislado de una muestra patológica de archivo. En una realización, una muestra incluida en parafina es primero desparafinada. Un procedimiento de desparafinización ejemplar comprende lavar la muestra parafinada con un disolvente orgánico, preferentemente xileno. Las muestras desparafinadas pueden ser rehidratadas con una solución acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados incluyen metanol, etanol, propanoles y butanoles. En una realización, las muestras desparafinadas se... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la recuperación de ARN de una muestra de tejido fijada con formalina e incluida en parafina, que comprende: calentar la muestra en una solución caotrópica que comprende una concentración efectiva de un agente caotrópico a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 °C durante un período de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos; y recuperar dicho ARN a partir de dicha solución caotrópica, en la que la solución caotrópica es urea, formamida, yoduro de potasio y tiocianato de potasio. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además desparafinar la muestra. 3. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende además rehidratar la muestra antes del calentamiento. 4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende además homogeneizar dicha muestra antes del calentamiento. 5. El procedimiento de cualquier reivindicación 1 a 4 para la recuperación de ARN a partir de una muestra de tejido biológico en la que dicho ARN es recuperado por extracción a partir de dicha solución caotrópica con un disolvente orgánico insoluble en agua. 6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que dicho disolvente orgánico insoluble en agua consiste esencialmente de cloroformo. 7. El procedimiento de la reivindicación 6 que además comprende purificar dicho ARN. 8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho ARN es purificado por precipitación con etanol. 9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho período de tiempo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos. 10. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho período de tiempo es de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. 11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha temperatura está en el intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 °C. 12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha temperatura está en el intervalo de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 °C. 13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha solución caotrópica tiene un pH de aproximadamente 3-6. 14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que dicha solución caotrópica tiene un pH de aproximadamente 4. 15. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha solución caotrópica comprende además un agente reductor. 16. El procedimiento de la reivindicación 15 en el que dicho agente reductor se selecciona de ß-mercaptoetanol y ditiotreitol. 17. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho ARN se utiliza para determinar el nivel de expresión de un gen diana. 18. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho ARN es además sometido a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de transcripción reversa, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa, electroforesis, cromatografía, hibridación con una sonda de ácido nucleico, y fragmentación. 19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el ARN se somete a transcripción reversa y el ADNc así producido es marcado. 20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el ADNc marcado se utiliza en un chip génico o un análisis de microarreglos. 11 E06123097 01-12-2011   21. Un procedimiento para la medición cuantitativa de la expresión génica de genes diana que comprende la recuperación de ARN mediante un procedimiento como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, que comprende además: convertir el ARN purificado a ADNc mediante una reacción de transcripción reversa; someter el ADNc a una reacción de PCR en una solución de reacción en cadena de la polimerasa que comprende una sonda de oligonucleótidos adecuada para amplificar al menos una secuencia específica, una polimerasa y un fluorocromo; medir el cambio que se produce en la intensidad de la fluorescencia como resultado de la reacción de PCR; y determinar, sobre la base del cambio en la intensidad de la fluorescencia, la cantidad de un ácido nucleico que tiene una secuencia específica presente en la muestra. 22. Un procedimiento para determinar el nivel de expresión de un gen diana en una muestra de tejido fijada incluida en parafina que comprende: desparafinar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinada; aislar el ARNm de la muestra desparafinada calentando primero la muestra de tejido desparafinada en una solución que comprende una concentración efectiva de un agente caotrópico a una temperatura en el intervalo de 50 a 100 °C y recuperar dicho ARNm de d icha solución; y determinar la cantidad de ARNm de un gen diana en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno. 23. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que el gen de control interno es ß-actina. 24. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que el gen diana es Timidilato Sintasa (TS). 12 E06123097 01-12-2011   Figura 1 13 E06123097 01-12-2011   Figura 2 14 E06123097 01-12-2011   Figura 3 E06123097 01-12-2011   Figura 4 16 E06123097 01-12-2011   Figura 5 17 E06123097 01-12-2011   Figura 6 18 E06123097 01-12-2011   Figura 7 19 E06123097 01-12-2011   Figura 8 E06123097 01-12-2011