Dominio VHH monomérico o dimérico caracterizado por que comprende al menos una secuencia capaz deunirse a proteína de rotavirus VP6 seleccionada del grupo:

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ IDNO: 4.

Dominio VHH monomérico derivado de anticuerpos de camélidos anti-VP6, dominio dimérico, método de inmunización, método de detección de rotavirus, composición, métodos de prevención y tratamiento de infecciones 5 por rotavirus.

La presente invención se refiere a un dominio VHH monomérico derivado de anticuerpos de camélidos anti-VP6, dominio dimérico, método de inmunización, método de detección de rotavirus, composiciones, métodos de prevención y tratamiento de infecciones con rotavirus. Más específicamente se refiere a un dominio (VHH) monomérico derivado de anticuerpos de camélidos, en donde dicho dominio puede ser cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y en donde dichos dominios se unen a la proteína VP6 de rotavirus del grupo A.

Antecedentes de la invención

Rotavirus (RV) Grupo A es la principal causa de diarrea severa en niños y en las crías de muchas especies animales de interés económico (bovinos, porcinos, equinos, camélidos Sudamericanos, etc) . Como problema de salud pública, RV es la tercera causa de muerte más común asociada con diarrea severa en los países en desarrollo (2 millones de muertes por año) . Por otro lado, la diarrea inducida por RV en animales para consumo, por ejemplo terneros jóvenes, provoca elevados gastos relacionados con la prevención o el tratamiento.

Los RV Grupo A son partículas conformadas por una triple cápside proteica. La superficie de la cápside externa esta conformada por las proteinas VP4 y VP7, ambos antígenos altamente variables; hasta el momento se han descrito al menos 27 variantes de VP4 (P-tipos) y 16 variantes de VP7 (G-tipos) . Cada combinación de G-P tipo induce

anticuerpos neutralizantes de baja reactividad cruzada con otros G-P tipos, por lo cual es necesario incluir en las vacunas las distintas cepas circulantes en la especie destino.

La cápside intermedia esta constituida por la proteína trimérica VP6, que representa el 51% de la masa del virión. Dependiendo de la presencia o ausencia de dos epítopos diferentes en la proteína VP6 (reconocidos por los anticuerpos monoclonales mAb 255/60 y 631/9) , las cepas de RV grupo A son adicionalmente clasificadas como subgrupos (Sb) I, II, I+II y noI noII. Los RV humanos son usualmente Sb II, mientras que los RV animales son principalmente Sb I. La proteína VP6 es altamente inmunogénica; los humanos y animales infectados de manera natural desarrollan una fuerte respuesta humoral contra los epítopos de VP6. Independientemente de los subgrupos mencionados anteriormente, VP6 es una proteína altamente conservada dentro de todos los RV Grupo A (>90% de

homología de aminoácidos) , y los antígenos comunes compartidos pueden ser detectados por antisueros policlonales o por anticuerpos monoclonales ampliamente reactivos. Por lo tanto, VP6 es el antígeno blanco de la mayoría de los exámenes de inmunodiagnóstico diseñados para la detección de RV Grupo A. Los anticuerpos dirigidos contra esta proteína no poseen actividad neutralizante in vitro. Sin embargo anticuerpos monoclonales IgA logran bloquear la replicación viral intracelularmente en ratones.

Actualmente, la prevención de diarrea en animales inducida por RV se basa en la inmunización pasiva, mientras que en seres humanos se utiliza la inmunización activa. En los animales, se aplican vacunas parenterales de virus inactivados en las hembras preñadas, para proteger a los recién nacidos a través de la transferencia de anticuerpos maternos vía calostro y leche. Esta estrategia es altamente efectiva para prevenir los síntomas de la diarrea severa y

45 para reducir la morbilidad y mortalidad en los ganados afectados, pero no logra prevenir la infección por RV porque no reduce significativamente la cantidad de virus excretado por los animales infectados (Parreno, V., C. et al., Vet Immunol Immunopathol 100:7-24, 2004) . Solamente la presencia continua de títulos elevados de anticuerpos pasivos contra RV en el lumen del intestino, (naturalmente producidos o artificialmente agregados a la leche) protege completamente contra la diarrea y reduce significativamente la excreción viral (Fernandez, F. M., et al., Vaccine 16:507-16, 1998; Saif, L. J., et al., Infect Immun 41:1118-31, 1983 y Saif, L. J., et al., Adv Exp Med Biol 216B:181523, 987) .

En niños, se han aprobado dos vacunas de virus vivos atenuados mediante reasociación genética. Ambos productos han demostrado tener buena eficacia contra la diarrea severa inducida por RV. Sin embargo, dados los

55 antecedentes de intususcepción asociados a una vacuna previamente utilizada en humanos (Murphy, T. V., et al., J Infect Dis 187:1309-13. 2003) y el descubrimiento reciente de viremia de RV en niños infectados de manera natural (Ray, P., et al., J Infect Dis 194:588-93, 2006 y Blutt, S. E., et al., Lancet 362:1445-9, 2003) se ha puesto en discusión la inocuidad de dichas vacunas, especialmente en niños prematuros, inmunosuprimidos y desnutridos. Por lo tanto, se necesitan estrategias alternativas y complementarias para la prevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RV.

Las estrategias de inmunidad pasiva, tales como el amamantamiento, la administración de anticuerpos anti-RV purificados del calostro bovino o huevos (IgG anti-RV humana y bovina o IgY de la yema de huevo de gallina) , mostraron reducir la enfermedad diarreica tanto en humanos como en animales. Pero la posibilidad de producir 65 grandes cantidades de anticuerpos de una manera costo-eficiente y con propiedades reproducibles es baja. Es por lo tanto necesario generar anticuerpos diseñados para inmunización pasiva de animales y seres humanos contra

RV, particularmente anticuerpos que puedan producirse a escala industrial, que no produzcan reacciones inmunológicas, que sean suficientemente pequeños para acceder eficientemente a los epítopos de proteínas internas, conservadas y, que sean capaces de reconocer e inhibir la replicación de cepas de diferentes genotipos (polirreactivos) .

El dominio VHH de la cadena pesada de los anticuerpos de los camélidos es, con un peso de 15 kDa, el dominio natural más pequeño conocido con capacidad completa de unión al antígeno, es ideal para la generación de bibliotecas de ADN codificante para fragmentos de cadena única con capacidad natural de reconocimiento de antígenos. Además, se pueden usar estrategias de inmunización de la llama para enriquecer la biblioteca de VHH en aquellos dirigidos contra un antígeno de interés. Debido a sus propiedades particulares, los dominios VHH derivados de cadenas pesadas de anticuerpos de llama son herramientas muy versátiles para el desarrollo de reactivos de diagnóstico y productos diseñados para prevenir o tratar la diarrea inducida por RV. Por ejemplo, se ha reportado recientemente que un VHH dirigido contra una cepa de RV de G-tipo G3, producido en levaduras, mostró actividad neutralizante in vitro, y que el VHH purificado fue capaz de reducir la aparición y la duración de la diarrea inducida

por RV en ratones lactantes, (Pant, N., et al., J Infect Dis 194:1580-8, 2006 y van der Vaart JM, et al., Vaccine. May 8; 24 (19) :4130-7, 2006) . Sin embargo estos autores no han podido identificar contra qué proteína viral están dirigidos los VHH obtenidos y suponen que estarían dirigidos contra epítopos conformacionales de las proteínas externas.

El documento de patente WO 2006/056306 divulga la producción y el uso de dominios VHH o fragmentos de los mismos para terapia de las infecciones producidas por microorganismos entero-patógenos, por ejemplo RV. Se muestra la producción de dichos VHH o su uso en un sistema de liberación sitio específico. Por ejemplo, se divulga la liberación de los VHH específicos en el sistema gastrointestinal mediante su encapsulación en alginato. Se propone además como método de liberación el uso de microorganismos probióticos transgénicos que liberan los

anticuerpos VHH específicos y en donde dichos microorganismos pueden colonizar el intestino humano. Se proponen diferentes estrategias de elaboración de medicamentos o alimentos empleando los anticuerpos VHH encapsulados o expresados por microorganismos probióticos. Los VHH producidos no se unen a VP6, no serían neutralizantes y tampoco son empleados solos, sino que se emplean en un sistema de liberación controlada.

El documento de patente US 20050054001 de Muyldermans Serge divulga anticuerpos de cadenas pesadas, dominios funcionales... [Seguir leyendo]

1. Dominio VHH monomérico o dimérico caracterizado por que comprende al menos una secuencia capaz de

unirse a proteína de rotavirus VP6 seleccionada del grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID 5 NO: 4.

2. El dominio, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que deriva de anticuerpos de camélidos seleccionados del grupo: Lama glama, Lama pacos, Lama guanicoe y Vicugna vicugna.

3. El dominio, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que se une a un epítopo lineal del antígeno VP6 presente en grupo A de rotavirus.

4. Dominio dimérico, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que comprende dos secuencias,

idénticas o diferentes, seleccionadas del grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. 15

5. Dominio dimérico, de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que comprende además un enlace de SEQ ID NO: 13.

6. Dominio dimérico, de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además una secuencia seleccionada del 20 grupo: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

7. Un método de inmunodetección de rotavirus caracterizado por que comprende: a) poner en contacto una muestra que contenga rotavirus con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o

combinaciones de las mismas; y b) revelar.

8. El método, de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que se selecciona del grupo: ensayos basados en inmunocaptura ELISA, ELISPOT, ELISA de competición, perlas magnéticas y test de campo in situ (a pie de establo) .

9. Una composición diseñada para otorgar inmunidad pasiva a un mamífero, caracterizada por que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o combinaciones de las mismas; excipiente e inmunomoduladores.

10. Plásmido pFBMeIVHH, depositado con el número de acceso CECT7431 el 02.07.08, caracterizado por comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los dominios monoméricos o diméricos de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Vector de expresión recombinante caracterizado por comprender el plásmido de la reivindicación 10.

12. Vector de expresión recombinante, de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que dicho vector es un virus, particularmente un Baculovirus.

45 13. Células transgénicas transformadas, transfectadas o infectadas con el vector de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizadas por que expresan el ADN incluido en el plásmido de la reivindicación 10.

14. Método para la producción de los dominios de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende las siguientes etapas:

50 a) Transformar, transfectar o infectar células hospedadoras en cultivo o en larvas de insectos con el vector recombinante de las reivindicaciones 11 o 12. b) Mantener las células creciendo en condiciones apropiadas. c) Aislar y purificar los dominios.

55 15. Anticuerpos caracterizados por comprender cualquiera de los dominios de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Un kit para inmunodetección de rotavirus que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o combinaciones de las mismas.

17. Secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o combinaciones de las mismas, para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de infecciones producidas por rotavirus.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

Literatura no patente citada en la descripción