Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados.

Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica que comprende

(i) una primera cadena de inmunoglobulina de un primer miembro de la superfamilia inmunoglobulinanatural y

(ii) una segunda cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente de un segundo miembro diferentede dicha superfamilia inmunoglobulina natural,

en donde cada una de las cadenas de inmunoglobulina modificada genéticamente comprende un dominio CH3 deanticuerpo que comprende un dominio de la interfaz de interacción proteína-proteína híbrido, en donde cada dichodominio de la interfaz de interacción está formado por segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho primermiembro y segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho segundo miembro,

en donde, dicho dominio de la interfaz proteína-proteína de la primera cadena está interactuando con la interfazproteína-proteína de la segunda cadena mediante homodimerización de los correspondientes segementos deaminoácidos del mismo miembro de la superfamilia inmunoglobulina dentro de dichos dominios de interacción.

Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados Área de la invención.

La presente invención hace referencia a dominios de inmunoglobulina heterodimérica y métodos de producción de los mismos.

Antecedentes de la invención La naturaleza proporciona una gran cantidad de proteínas heterodiméricas y dominios de proteínas que se encuadran en familias de proteínas relacionadas. Tales proteínas y dominios forman, a menudo, homodímeros entre ellos, pero no forman heterodímeros con otros miembros de la familia. Por otro lado, las proteínas heterodiméricas o heteromultiméricas resultan útiles a menudo. Proporcionan herramientas de investigación y de terapéutica novedosas. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos (BsAbs, por sus siglas en inglés) capaces de unirse a, al menos, dos antígenos diferentes, presentan un potencial significativo en una amplia gama de aplicaciones clínicas como agentes de determinación de dianas, para inmunodiagnosis y terapia in vitro e in vivo, y para inmunoensayos diagnósticos. En el área diagnóstica, los BsABs han resultado de gran utilidad en hibridar las propiedades funcionales de las moléculas de la superficie celular, y en definir la habilidad de los diferentes receptores Fc para mediar en la citotoxicidad (Fanger et al. (1992) Crit. Rev. Immunol, 12:101-124, los contenidos de la cual se incorporan a la presente patente a modo de referencia) . Sin embargo, cuando los BsAbs se generan simplemente por coexpresión de múltiples componentes que pueden interactuar sin especificidad, se genera una gran cantidad de especies, y resulta difícil a menudo separar las especies deseadas de las especies no deseadas. Por lo tanto, resulta deseable poseer técnicas para producir heteromultímeros de manera eficiente. Resulta particularmente deseable generar subunidades de anticuerpos que formen heterodímeros de manera preferente a la formación de homodímeros, de manera que los BsAbs puedan ser recuperados directamente de cultivos celulares recombinantes.

Se ha informado sobre métodos de realización de proteínas heterodiméricas. Por ejemplo, Stahl y Yancopoulos han descrito el uso de las proteínas de fusión que incluyen dos subunidades receptoras diferentes para formar receptores heterodiméricos solubles que podían unirse a una citocina dada en circulación, y por tanto bloquear la actividad de dicha citocina (ver la Patente Estadounidense No. 6, 472, 179) . Carter et al. han descrito un enfoque “protuberancia en la cavidad” para generar una fracción Fc heterodimérica (ver Patente Estadounidense No. 5, 807, 706) .

Estos métodos existentes permiten las construcciones de heterodímeros individuales, pero no proporcionan técnicas generales para la construcción de proteínas multiméricas que implican interacciones de múltiples dominios. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema general para el diseño de pares heterodiméricos que puedan ensamblarse de manera específica en un entorno que contenga múltiples compañeros de ensamblaje potenciales diferentes.

Resumen de la invención La presente invención proporciona una aproximación novedosa para el diseño de dominios de inmunoglobulina que se heterodimerizan, de manera preferente. En particular, la presente invención utiliza una estrategia de “Dominio Modificado por Intercambio de Cadena” (Strand Exchange Engineered Domain) (SEED, por sus siglas en inglés) , para modificar por ingeniería genética la interfaz de interacción proteína-proteína dentro de dicha heterodimerización de dominios de inmunoglobulina. La invención también proporciona inmunoglobulinas que contienen dominios modificados por ingeniería genética utilizando el método de la presente invención.

En un aspecto, la presente invención presenta una inmunoglobulina heterodimérica multidominio, que incluye al menos un primer y un segundo dominio modificados no idénticos, cada uno de los cuales contiene una interfaz de interacción proteína-proteína que contiene segmentos de secuencia de aminoácidos derivados de dos o más dominios parentales homólogos naturales, concediendo, de ese modo, a los dominios primero y segundo modificados especificidades de ensamblaje distintas de las especificidades de ensamblaje de los dominios parentales, en donde los dominios primero y segundo modificados forman heterodímeros entre sí, de manera preferente a la formación de homodímeros (por ejemplo, los heterodímeros constituyen más del 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de la cantidad total de dímeros) . Los dominios primero y segundo modificados no son dominios variables de anticuerpos. En algunos modos de realización, la inmunoglobulina multidominio de la invención incluye una primera subunidad que contiene el primer dominio modificado, y una segunda subunidad que contiene el segundo dominio modificado. Tal como se utiliza en la presente patente, un “segmento de secuencia de aminoácidos” incluye cualquier segmento de secuencia que contiene dos o más aminoácidos (por ejemplo, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más) .

En realizaciones preferentes, la inmunoglobulina multidominio incluye dominios no idénticos modificados por ingeniería genética a partir de dominios parentales homólogos naturales, por ejemplo, dominios CH3 de anticuerpos. En particular, los dominios modificados se derivan de los dominios CH3 de la IgG y la IgA.

En algunas realizaciones, la inmunoglobulina multidominio de la invención incluye dominios modificados que forman parte de cadenas polipeptídicas que se encuentran conectadas mediante un puente disulfuro.

En un modo de realización, uno de los dominios modificados contenidos en la inmonoglobulina mulitidominio de la invención, incluye, al menos, dos segmentos de secuencia no adyacentes derivados del mismo dominio parental. En otro modo de realización, cada uno de los dominios primero y segundo incluye al menos dos, tres, o cuatro o más segementos de secuencia no adyacentes, derivados a partir del mismo dominio parental. En otro modo de realización, al menos uno de los dominios modificados incluye segmentos de secuencia de cada dominio parental que son de, al menos, dos aminoácidos de longitud. En otro modo de realización, al menos uno de los dominios modificados incluye segmentos de secuencia de cada dominio parental que son de, al menos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos de longitud.

En algunos modos de realización, la inmunoglobulina multidominio de la invención incluye un primer dominio bioactivo. El primer dominio bio-activo puede ocupar una posición N-terminal o C-terminal con respecto al primer dominio modificado.

En modos de realización adicionales, la inmunoglobulina multidominio puede incluir, adicionalmente, un segundo dominio bio-activo además del primer dominio bio-activo. En un modo de realización, el segundo dominio bio-activo se encuentra asociado al segundo dominio modificado, y puede ocupar una posición N-terminal o C-terminal con respecto al segundo dominio modificado. En una realización alternativa, el segundo dominio bio-activo se encuentra también asociado al primer dominio modificado, y puede ocupar una posición opuesta al primer dominio bio-activo. Por ejemplo, los dominios bio-activos primero y segundo pueden ocupar posiciones N-terminal y C-terminal, respectivamente, respecto al primer dominio modificado.

La inmunoglobulina multidominio de la presente invención puede ser utilizada para generar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, la proteína multidominio puede incluir un primer dominio bio-activo que contenga un dominio variable de anticuerpo, y un segundo dominio bio-activo que contenga un segundo dominio variable de anticuerpo con especificidad distinta.

En otro aspecto, la invención proporciona una inmunoglobulina multidominio, en donde la primera región bio-activa contiene dos o más dominios variables de anticuerpos de una primera especificidad, o de una primera combinación de especificidades. La proteína multidominio puede también contener una segunda región bio-activa que incluya dos o más dominios variables de anticuerpos de una segunda especificidad o una segunda combinación de especificidades. Por ejemplo, la proteína multidominio puede incluir una o más fracciones Fv de cadena única, un diacuerpo de cadena única [un VH (1) – VL (2) -----VH (2) – VL (1) ], u otras repeticiones fusionadas a Fv de cadena única (de las mismas o diferentes especificidades) .

En otro aspecto, la invención proporciona una inmunoglobulina multidominio en donde la primera región bio-activa comprende dos o más dominios variables de anticuerpos de una primera especificidad o de una primera combinación de especificidades.... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica que comprende

(i) una primera cadena de inmunoglobulina de un primer miembro de la superfamilia inmunoglobulina natural y

(ii) una segunda cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente de un segundo miembro diferente de dicha superfamilia inmunoglobulina natural,

en donde cada una de las cadenas de inmunoglobulina modificada genéticamente comprende un dominio CH3 de anticuerpo que comprende un dominio de la interfaz de interacción proteína-proteína híbrido, en donde cada dicho dominio de la interfaz de interacción está formado por segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho primer miembro y segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho segundo miembro,

en donde, dicho dominio de la interfaz proteína-proteína de la primera cadena está interactuando con la interfaz proteína-proteína de la segunda cadena mediante homodimerización de los correspondientes segementos de aminoácidos del mismo miembro de la superfamilia inmunoglobulina dentro de dichos dominios de interacción.

2. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 1, en donde el primer miembro de la superfamilia inmunoglobulina es la IgG y el segundo miembro es la IgA.

3. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 2, en donde los aminoácidos que interactúan con FcRn se derivan de la IgG para preservar la interacción con FcRn.

4. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 2, en donde la primera o segunda cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente tiene la secuencia polipeptídica ("AG-SEED") : GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPX1DIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTX2DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKX3ISL (SEQ ID NO:1) , en donde X1, X2, y X3 pueden ser cualquier aminoácido.

5. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 4, en donde X1 es K o S, X2 es V o T, y X3 es T o S.

6. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 2, en donde la primera o segunda cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente tiene la secuencia polipeptídica ("GA-SEED") : GQPREPQVYTLPPPSEELALNEX1VTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWX2PVX3DSD GSX4FLYSILRVX5AX6DWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR (SEQ ID NO:2) , en donde X1, X2, X3, X4, X5, y X6 pueden ser cualquier aminoácido.

7. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 6, en donde X1 es L o Q, X2 es A o T, X3 es L, V, D, o T; X4 es F, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S o T; X5 es A o T, y X6 es E o D.

8. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 2, en donde la primera cadena de inmunoglobulina tiene la secuencia polipetídica ("AG-SEED") : GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL (SEQ ID NO:3) y la segunda cadena de inmunoglobulina tiene la secuencia polipeptídica ("GA-SEED") : GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR (SEQ ID NO:6) .

9. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 2, en donde la primera cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente tiene la secuencia polipeptídica ("AG-SEED") : GQPFEPEVHTLPPSREEMTKNQVSLTCLVRGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRLEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL (SEQ ID NO:10) y la segunda cadena de inmunoglobulina modificada genéticamente tiene la secuencia polipeptídica ("GA-SEED") : GQPREPQVYTLPPPSEELALNNQVTLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVDASRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL (SEQ ID NO:11) .

10. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 1, en donde al menos un dominio bio-activo se fusiona a las fracciones de la molécula heterodimérica.

11. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 10, en donde dicho dominio bio-activo es una región variable o constante de un anticuerpo.

12. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 11, en donde

dicha región variable es un dominio VL, un dominio VH, un Fv, un Fv de cadena única, un diacuerpo, un fragmento 5 Fab, un Fab de cadena única, o un F (ab’) 2.

13. Un ácido nucleico que codifica una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente de la reivindicación 1.

14. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 11, en donde dicha molécula modificada genéticamente es un anticuerpo multiespecífico.

15. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico.

16. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 10, en donde dicho dominio bio-activo es una hormona, una citocina, una quimiocina, un ligando, una enzima secretada o una porción extracelular de un receptor transmembrana.

17. Una molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 1, en donde las secuencias se encuentran modificadas para reducir su inmunogenicidad potencial.

18. La molécula de inmunoglobulina modificada genéticamente heterodimérica de la reivindicación 17, en donde la secuencia AG-SEED de SEQ ID NO:3 y la secuencia GA-SEED de SEQ ID NO:6 se encuentran modificadas para eliminar uno o más epítopos de linfocitos T presentes en la secuencia SEED, en donde la modificación es la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos.