Un procedimiento de cuantificación rápida de bacterias Legionella viables en una muestra,

comprendiendo el procedimiento:

a. proporcionar una placa de cultivo laminar que comprende un medio absorbente, en la que el medio absorbente comprende nutrientes para cultivar Legionella y al menos un agente para inhibir selectivamente el desarrollo de microorganismos no-Legionella;

b. poner en contacto la placa de cultivo laminar con la muestra durante un periodo de tiempo predeterminado, en el que la placa de cultivo laminar se calibra para absorber una cantidad predeterminada de la muestra;

c. incubar la placa de cultivo laminar a una temperatura en el intervalo de 30 º C a 45 º C durante un periodo de 6 horas a 48 horas;

d. detectar microcolonias de bacterias Legionella en la placa de cultivo laminar con un reactivo de detección, en el que el agente de detección identifica selectivamente Legionella;

e. formar imágenes de las colonias detectadas con una cámara digital, detectándose las microcolonias bajo un aumento en el orden de 2X a 10X; y

f. cuantificar la cantidad de bacterias Legionella viables en la muestra.

Detectar y cuantificar rápidamente Legionella viable

5 Antecedentes

La enfermedad del legionario es un nombre común para una de las varias enfermedades causadas por la bacteria Legionella o de la enfermedad del legionario (LDB) . La legionelosis es el estado de estar infectado por bacterias Legionella que puede causar neumonía grave. Con mucho, la mayoría de las legionelosis son el resultado de exposición a sistemas de agua de edificios contaminados. Cada año, cientos de miles de personas padecen estas infecciones y muchas decenas de miles mueren debido a legionelosis o sus complicaciones.

Se han clasificado aproximadamente cuarenta y ocho especies de Legionella con 70 serogrupos. L. pneumophila es responsable de aproximadamente el 80%-85% de las infecciones por Legionella y los serogrupos 1 15 y 6 son responsables de dos tercios de las infecciones por Legionella. Otros aislados y serogrupos también contribuyen a infecciones por Legionella. Existen 15 serogrupos de L. pneumophila y aproximadamente 70 serogrupos en total para Legionella. Algunos de los aislados y serogrupos de Legionella que causan infección incluyen L. longbeachae, L. bozemanii, L. micdadei, L. dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii y L. anisa. Se han propuesto dos géneros adicionales: especies que emiten fluorescencia azul-blanca de Fluoribacter tales como L.

bozemanii y Tatlockia para la especie L. micdadei.

La Legionella está ampliamente presente en niveles bajos en el entorno: en lagos, arroyos y estanques. Los calentadores de agua, sistemas de distribución de agua potable, fuentes decorativas, baños de spa, piscinas, humidificadores, torres de agua de refrigeración por evaporación y agua estancada caliente proporcionan las 25 condiciones ideales para el desarrollo y transmisión del riesgo biológico. El agua estancada caliente proporciona las condiciones ideales para el desarrollo. A aproximadamente 30 º C-50 º C (75º -122 º F) , el microorganismo se puede multiplicar de forma significativa y rápidamente dentro de su hospedador protozoario, la mayoría de las veces protozoos acuáticos que incluyen diferentes géneros de amebas. El óxido (hierro) , incrustaciones y la presencia de otros microorganismos también pueden promover las condiciones que dan como resultado el rápido desarrollo de Legionella.

Las medidas preventivas incluyen el mantenimiento y la limpieza regular de sistemas de agua de edificios, tales como torres de refrigeración y condensadores por evaporación para prevenir el desarrollo de Legionella, que debe incluir típicamente, por ejemplo, la limpieza dos veces al año y el uso periódico de cloro u otros desinfectantes eficaces; mantener los calentadores de agua domésticos a 60 º C (140 º F) ; y evitar las condiciones que permiten que se estanque el agua, tales como, por ejemplo, grandes depósitos de almacenamiento de agua expuestos a calor de la luz solar que producen condiciones de calor favorables a altos niveles de Legionella y su hospedador protozoario.

De la técnica anterior se conocen varios enfoques para la detección y cuantificación de Legionella.

El documento DE 29 36 294 A1 describe bacterias en desarrollo sobre un dispositivo de placa de cultivo laminar que contiene medio complejo pero selectivo, que contiene inhibidores que evitan el desarrollo de bacterias contaminantes.

45 [0007] El documento WO 02/102824 A describe un procedimiento para detectar bacterias en agua potable y agua superficial, especialmente un procedimiento para la detección específica simultánea de bacterias de las especies de Legionella y la especie Legionella pneumophila mediante hibridación in situ.

Una publicación científica de Bartie C. et al ("Identification methods for Legionella from environmental 50 samples", Water Research 37 (6) : 1362-1370, 2003) también trata de la detección y cuantificación de Legionella.

La detección de Legionella mediante el Procedimiento Convencional, tal como se requiere por muchas directrices respaldadas por el gobierno, códigos de práctica, estándares, regulaciones o leyes tales como, por ejemplo, las directrices de la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional (OSHA) , necesita aproximadamente 55 10 días debido al largo tiempo de incubación requerido para que se desarrolle Legionella detectable. Por tanto, la confirmación definitiva de Legionella viable requiere aproximadamente diez días cuando se usa el Procedimiento Convencional para la detección. Durante este periodo la Legionella se habría multiplicado y propagado in situ y en muchos casos las instalaciones se tienen que clausurar, dando como resultado retrasos en la producción u ocupación limitada o evacuación y, por lo tanto, sustanciales pérdidas económicas. De acuerdo con las 60 especificaciones de la OSHA, se puede considerar que un sitio está potencialmente contaminado de forma peligrosa con bacterias Legionella si están presentes al menos 10 unidades formadoras de colonias (UFC) /ml de Legionella en un sistema de distribución de agua potable o 100 UFC/ml en un sistema de enfriamiento de agua. En humidificadores se considera incluso 1 UFC/ml potencialmente peligrosa de acuerdo con estas directrices de la OSHA.

65 [0010] Para el Procedimiento Convencional se usa un medio de extracto de levadura y carbón tamponado (BCYE) para desarrollar y cultivar Legionella. Varios refinamientos y mejoras dieron como resultado el medio BCYE preferido actualmente, que está enriquecido con !-cetoglutarato (medio BCYE-! de Edelstein) con y sin agentes antimicrobianos selectivos y colorantes indicadores. Este medio puede complementarse con albúmina sérica bovina en algunos casos.

El Procedimiento Convencional, tal como se describe en la publicación de 1998 titulada "Water QualityDetection and Enumeration of Legionella", de la Organización Internacional de Normalización de Ginebra, Suiza, que se denomina de forma común la norma ISO 11731, especifica el uso del medio BCYE-! complementado 10 con glicina sin amoniaco, vancomicina, polimixina B y cicloheximida (GVPC) . Además de estos complementos, GVPC contiene pirofosfato férrico, L-cisteína, !-cetoglutarato. Este procedimiento es en general coherente con el procedimiento original desarrollado por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades y con los procedimientos convencionales usados en Australia y Singapur (AU/NZ 3896) . Se usa un procedimiento que es sustancialmente similar a estos en Francia (AFNOR T90431) . En este Procedimiento Convencional, al igual que con los otros, se requieren etapas de selectividad, tales como tratamiento con ácido y/o tratamiento con calor para inhibir la competencia de bacterias que crecen más rápido que pueden superar a la Legionella en la muestra.

El Procedimiento Convencional requiere un protocolo para obtener las muestras, enviar las mismas de vuelta a un laboratorio de análisis y utiliza un medio especializado. El procedimiento requiere extender un pequeño 20 volumen de muestra (0, 1 ml) sobre la superficie de agar de extracto de levadura y carbón tamponado complementado con factores de crecimiento y antibióticos e incubar después los medios y la muestra a una temperatura y humedad constantes durante hasta 10 días. El largo tiempo de incubación es necesario debido a que las bacterias Legionella se desarrollan lentamente en este medio de cultivo. El desarrollo sobre la superficie de agar tiene que ser suficiente para que un microbiólogo cuente el número de unidades formadoras de colonias (UFC)

sobre la superficie del agar después de hasta diez días de incubación. El recuento de UFC se usa para determinar una concentración de células viables calculando el valor por unidad de volumen. Por ejemplo, una placa con 10 UFC de 0, 1 ml de muestra no diluida indica una concentración de Legionella viable de 100 UFC/ml de muestra.

Sin embargo, varios factores limitan el uso del procedimiento de cultivo Convencional. En primer lugar, la experiencia de un analista con el Procedimiento Convencional está correlacionada directamente con la cuantificación de patógeno. En segundo lugar, el Procedimiento Convencional requiere diez días para obtener resultados confirmados, debido al lento desarrollo de Legionella sobre placas de agar y los ensayos de confirmación requeridos. En tercer lugar, la preparación del medio tiende a error y requiere un extenso control de calidad. En cuarto lugar, el patógeno es sensible a factores que son difíciles de controlar durante el tránsito de la muestra. En quinto lugar, las etapas de concentración usadas para conseguir menores límites de detección... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cuantificación rápida de bacterias Legionella viables en una muestra, comprendiendo el procedimiento: 5

a. proporcionar una placa de cultivo laminar que comprende un medio absorbente, en la que el medio absorbente comprende nutrientes para cultivar Legionella y al menos un agente para inhibir selectivamente el desarrollo de microorganismos no-Legionella;

b. poner en contacto la placa de cultivo laminar con la muestra durante un periodo de tiempo predeterminado, 10 en el que la placa de cultivo laminar se calibra para absorber una cantidad predeterminada de la muestra;

c. incubar la placa de cultivo laminar a una temperatura en el intervalo de 30 º C a 45 º C durante un periodo de 6 horas a 48 horas;

d. detectar microcolonias de bacterias Legionella en la placa de cultivo laminar con un reactivo de detección, en el que el agente de detección identifica selectivamente Legionella;

e. formar imágenes de las colonias detectadas con una cámara digital, detectándose las microcolonias bajo un aumento en el orden de 2X a 10X; y f. cuantificar la cantidad de bacterias Legionella viables en la muestra.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio absorbente comprende agarosa en un intervalo del 20 0, 5% en peso al 10, 0% en peso.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el reactivo de detección se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, una mezcla de anticuerpos, una sonda y combinaciones de los mismos.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es específico para Legionella seleccionada entre el grupo que consiste en los serogrupos 1-15 de Legionella pneumophila, L. longbeachae, L. bozemanii, L. micdadei, L. dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii y L. anisa.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la sonda se selecciona entre el grupo que consiste en un colorante, un colorante potenciador del color, un colorante de contraste de fases, una sonda marcada, una sonda fluorescente, una sonda colorimétrica, una sonda de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la detección de Legionella es mediante una fuente de luz

ultravioleta. 35

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio absorbente se calibra para absorber aproximadamente 0, 3 ml de la muestra en aproximadamente 60 segundos.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el reactivo de detección aumenta el contraste para la formación 40 de imágenes del desarrollo de Legionella.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el reactivo de detección destruye la Legionella.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el reactivo de detección comprende un compuesto 45 antimicrobiano.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el compuesto antimicrobiano se selecciona entre el grupo que consiste en isotiazolona, glutaraldehído, formaldehído, compuestos cuaternarios de amonio, dibromonitrilopropionamida, #-bromonitroestireno, antimicrobianos de carbamato, antimicrobianos de tris

50 nitrometano, benzoato sódico, ácidos orgánicos, etanol, isopropanol, gluconato de clorhexidina, diacetato de clorhexidina y o-fenil fenol.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente para inhibir selectivamente el desarrollo de microorganismos no-Legionella comprende colorantes, glicina, vancomicina y polimixina (DGVP) y/o un ácido 55 inorgánico o uno orgánico.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente para inhibir selectivamente el desarrollo de microorganismos no-Legionella comprende cefalotina, colistina, vancomicina y cicloheximida (CCVC) .

60 14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la microcolonia tiene 10-500 micrómetros de diámetro.