Detección de succinilacetona.

Un procedimiento para detectar una cetona biológicamente activa,

comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra con una disolución de extracción que comprende un monoalcohol C1-3 decadena lineal o ramificada y una base fuerte;

derivatizar una cetona biológicamente activa en la muestra; y

evaluar la cetona biológicamente activa derivatizada en la muestra derivatizada usando espectrometría demasas en tándem;

en el que la cetona biológicamente activa es succinilacetona o un esteroide.

Detección de succinilacetona.

ANTECEDENTES

La espectrometría de masas es útil para detectar y medir una amplia diversidad de metabolitos, cuya presencia o cantidad puede ser indicativa de ciertas dolencias o trastornos. Así, se puede usar la espectrometría de masas, por ejemplo, para diagnosticar numerosos trastornos metabólicos asociados con niveles alterados de metabolitos. Un trastorno metabólico de este tipo es la tirosinemia hereditaria, Tipo I (HT1) , que se produce por el déficit de fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH) que se asocia con niveles altos de tirosina y succinilacetona. HT1 es un trastorno de la infancia que produce fallo hepático, crisis neurológicas dolorosas, raquitismo, y hepatocarcinoma. Si no se trata, se produce la muerte típicamente con menos de 2 años de edad, permitiendo la supervivencia de algunas formas crónicas hasta los 12 años de edad. Ahora es posible tratar HT1 con NTBC (o Nitisinona) , si el tratamiento se inicia temprano en la vida. Así, hay un incentivo importante para identificar a los pacientes afectados por HT1 mediante cribado en los recién nacidos o incluso cribado prenatal.

RESUMEN

La succinilacetona es un marcador primario para la detección temprana de HT1. Sin embargo, la succinilacetona es una cetona muy reactiva que forma conjugados con proteínas. Los procedimientos que se describen en este documento se pueden usar para extraer succinilacetona de una muestra en condiciones que permiten extraer simultáneamente otros metabolitos, tales como aminoácidos, carnitina libre, o acilcarnitinas. Por ejemplo, se pueden evitar las condiciones de extracción severas (tales como acidez extrema y temperatura alta) .

Los procedimientos que se describen en este documento se pueden usar para detectar y/o medir succinilacetona y uno o más analitos biológicos adicionales usando espectrometría de masas (por ejemplo espectrometría de masas en tándem) . Dichos procedimientos son útiles en diagnóstico y para generar perfiles metabólicos para la detección/diagnóstico de trastornos metabólicos tales como aminoacidopatías (por ejemplo, tirosinemia tipo I) .

En un primer aspecto, la invención es un procedimiento para detectar una cetona biológicamente activa, 25 comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra con una disolución de extracción que comprende un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada y una base fuerte;

derivatizar la cetona biológicamente activa en la muestra; y evaluar la cetona biológicamente activa derivatizada en la muestra derivatizada usando espectrometría de 30 masas en tándem;

en el que la cetona biológicamente activa es succinilacetona o un esteroide.

Según un segundo aspecto, la invención es un procedimiento para extracción, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra con una disolución de extracción, comprendiendo la disolución de extracción: metanol y una base fuerte, en el que al poner en contacto la muestra con la disolución de extracción se produce un extracto que comprende:

(i) succinilacetona derivatizada;

(ii) uno o más aminoácidos;

(iii) carnitina libre;

(iv) una o más acilcarnitinas; o

(v) una forma derivatizada de (ii) , (iii) , o (iv) de la muestra, en el que la concentración de succinilacetona derivatizada en el extracto refleja la concentración de succinilacetona en la muestra, y en el que las concentraciones de uno o más aminoácidos, carnitina libre, una o más acilcarnitinas, o formas derivatizadas de las mismas en el extracto reflejan sus respectivas concentraciones en la muestra.

En un aspecto, la revelación proporciona un procedimiento para extracción. El procedimiento incluye las etapas de:

45 poner en contacto una muestra con una disolución de extracción, comprendiendo la disolución de extracción un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada y una base fuerte, en el que al poner en contacto la muestra con la disolución de extracción se produce un extracto que comprende: (i) succinilacetona derivatizada; (ii) uno o más aminoácidos; (iii) carnitina libre; (iv) una o más acilcarnitinas; o (v) formas derivatizadas de (ii) , (iii) , o (iv) de la muestra, y en el que la concentración de succinilacetona derivatizada en el extracto refleja la concentración de 50 succinilacetona en la muestra, y en el que las concentraciones de uno o más aminoácidos, carnitina libre, una o más

acilcarnitinas, o formas derivatizadas de las mismas en el extracto reflejan sus respectivas concentraciones en la muestra. El procedimiento también puede incluir, después de poner en contacto la muestra con la disolución de extracción, la etapa de analizar la muestra usando espectrometría de masas en tándem. La puesta en contacto puede derivatizar al menos una molécula de succinilacetona a ácido 3- (5-metil-1H-pirazol-3-il) propiónico (MPP) . El monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada puede ser metanol, etanol, propanol, o isopropanol. La base fuerte puede ser hidrazina, una hidrazina modificada (por ejemplo acilhidrazinas, arilhidrazinas, alquilhidrazinas, reactivos de Girard P y Girard T) , o hidroxilamina.

En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra biológica tal como una mancha de sangre seca. La muestra puede ser la que se obtenga de un ser humano recién nacido. La muestra puede ser la que se obtenga de un sujeto del que se sospecha que tiene un trastorno metabólico tal como tirosinemia tipo I, o tiene riesgo de desarrollarlo.

En algunas realizaciones, la disolución de extracción puede contener agua, un ácido orgánico, y/o uno o más patrones internos. Por ejemplo, la disolución de extracción puede contener entre aproximadamente 5% y aproximadamente 30% de agua o entre aproximadamente 20% y aproximadamente 25% de agua. El ácido orgánico puede ser ácido oxálico, por ejemplo a una concentración de aproximadamente 5mM. Los patrones internos pueden incluir al menos un isótopo pesado de un átomo tal como 2H, 15N, o 13C. Uno o más de los patrones internos puede ser, o contener, succinilacetona, un aminoácido, carnitina libre, una acilcarnitina, o forma derivatizada de cualquiera de los anteriormente mencionados.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir, después de poner en contacto la muestra con la disolución de extracción, la etapa de evaporar la muestra que da como resultado una primera muestra evaporada. El procedimiento puede incluir adicionalmente, después de evaporar la muestra, las etapas de poner en contacto la primera muestra evaporada con una disolución de alcohol alquílico que comprende un alcohol alquílico y un ácido. El procedimiento puede incluir adicionalmente, después de poner en contacto la muestra con la disolución de alcohol alquílico, las etapas de: evaporar la disolución que da como resultado una segunda muestra evaporada y/o reconstituyendo la segunda muestra evaporada. La reconstitución de la segunda muestra evaporada puede incluir poner en contacto la segunda muestra evaporada con un disolvente. El alcohol alquílico puede ser metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, t-butanol, o pentanol. El ácido puede ser ácido clorhídrico (HCl) . El disolvente puede incluir acetonitrilo, isopropanol, o una mezcla de agua con isopropanol o acetonitrilo.

En otro aspecto, la revelación proporciona un procedimiento para extracción, procedimiento que incluye las etapas de: poner en contacto una muestra con una disolución de extracción, comprendiendo la disolución de extracción un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada y una base fuerte, en el que al poner en contacto la muestra con la disolución de extracción se produce un extracto que comprende: (i) una cetona biológicamente activa derivatizada;

(ii) uno o más aminoácidos; (iii) carnitina libre; (iv) una o más acilcarnitinas; y/o (v) formas derivatizadas de cualquiera de (ii) , (iii) , o (iv) de la muestra, y en el que la concentración de la cetona biológicamente activa derivatizada en el extracto refleja la concentración de cetona biológicamente activa en la muestra, y en el que las concentraciones de uno o más aminoácidos, carnitina libre, una o más acilcarnitinas, o formas derivatizadas de las mismas en el extracto reflejan sus respectivas concentraciones en la muestra. El monoalcohol C1-3 de cadena lineal

o ramificada puede ser metanol, etanol, propanol, o isopropanol. La cetona biológicamente activa puede ser, por ejemplo, succinilacetona o un esteroide.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar una cetona biológicamente activa, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una muestra con una disolución de extracción que comprende un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada y una base fuerte; 5 derivatizar una cetona biológicamente activa en la muestra; y evaluar la cetona biológicamente activa derivatizada en la muestra derivatizada usando espectrometría de masas en tándem; en el que la cetona biológicamente activa es succinilacetona o un esteroide.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada es metanol, 10 etanol, propanol, o isopropanol.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada es metanol.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la base fuerte es hidrazina.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la disolución de extracción 15 comprende al menos 5% de agua.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la disolución de extracción comprende menos de 85% del monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cetona biológicamente activa se derivatiza con hidrazina o hidrazina derivatizada.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cetona biológicamente activa es succinilacetona.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que derivatizar succinilacetona en la muestra comprende derivatizar succinilacetona a ácido 3- (5-metil-1H-pirazol-3-il) propiónico (MPP) .

10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende además evaluar la muestra respecto a uno o más

analitos adicionales, en el que preferiblemente los uno o más analitos adicionales se evalúan con MPP en la misma inyección de muestra.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que comprende además determinar si un sujeto del que se tomó la muestra tiene, o presenta riesgo de desarrollar, tirosinemia hereditaria tipo I, sobre la base de la detección de succinilacetona en la muestra.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en el que se incluye en la muestra una succinilacetona derivatizada que comprende al menos un isótopo pesado de un átomo antes del análisis espectrométrico de masas.

13. Un procedimiento para extracción, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra con una disolución de extracción que comprende metanol y una base fuerte, en 35 el que el poner en contacto la muestra con la disolución de extracción produce un extracto que comprende:

(i) succinilacetona derivatizada;

(ii) uno o más aminoácidos;

(iii) carnitina libre;

(iv) una o más acilcarnitinas; o (v) una forma derivatizada de (ii) , (iii) , o (iv) de la muestra, en el que la concentración de la succinilacetona en el extracto refleja la concentración de succinilacetona en la muestra, y en el que la concentración de uno o más aminoácidos, carnitina libre, una o más acilcarnitinas, o formas derivatizadas de las mismas en el extracto refleja sus respectivas concentraciones en la muestra.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, que comprende además, después de poner en contacto la muestra con 45 la disolución de extracción, analizar la muestra usando espectrometría de masas en tándem.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 o la 14, en el que el poner en contacto derivatiza al menos una molécula de succinilacetona a ácido 3- (5-metil-1H-pirazol-3-il) propiónico (MPP) .

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que la muestra es una muestra de sangre seca.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el que la disolución de extracción comprende además un ácido orgánico, en la que preferiblemente el ácido orgánico es ácido oxálico. Categoría SA TYR Límites de corte 2* 575 Concentración media verdadero negativo 0, 51 93, 57 Verdadero negativo, SD 0, 13 25, 33 Verdadero negativo, % CV 25% 27% Muestra 1 - Replicado 1, concentración, μM 4, 42 65, 89 Muestra 1 - Replicado 1. Separación de la media TN en SD 30, 36 -1, 09 Muestr.

2. concentración, μM 5, 73 232, 31 Muestra 1 - Replicado 1. Separación de la media TN en SD 40, 55 5, 48