Métodos de espectrometría de masas para la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y niveles de metabolitos.

Método para detectar un trastorno metabólico, que es un trastorno de la oxidación de ácidos grasos,

trastorno de aciduria orgánica, aminoacidopatía o un trastorno indicado en la tabla 1 en un individuo, que comprende la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y niveles de metabolitos, caracterizado por:

(a) poner en contacto una muestra para determinar la presencia de

(i) una o más enzimas metabólicamente indicativas que tienen una actividad alterada como resultado de un trastorno metabólico y

(ii) uno o más analitos metabólicos, que tienen una cantidad alterada como resultado de un trastorno metabólico,

con uno o más sustratos para dicha una o más enzimas para producir una mezcla de reacción, en condiciones en las que al menos una de dichas enzimas puede actuar sobre un sustrato correspondiente para generar al menos un producto;

(b) poner en contacto dicha mezcla de reacción con un reactivo que inhibe la capacidad de dicha una o más enzimas para actuar sobre un sustrato correspondiente, en el que dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto son solubles en dicho reactivo; para producir una muestra de prueba y

(c) determinar la cantidad o presencia de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto contenidos en dicha muestra de prueba usando espectrometría de masas, en el que una cantidad o presencia determinada de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto se correlaciona con la presencia o ausencia de dicho trastorno metabólico.

Métodos de espectrometría de masas para la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y niveles de metabolitos

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere de manera general a la medicina de diagnóstico y más específicamente a métodos para diagnosticar trastornos metabólicos.

El metabolismo es el proceso de construcción de las estructuras moleculares del organismo a partir de nutrientes (anabolismo) y su descomposición para producir energía (catabolismo). Los procesos metabólicos dan como resultado crecimiento, producen energía, eliminan residuos y controlan la distribución de nutrientes en el organismo. La homeostasis, o un estado estacionario, en el organismo es un resultado del metabolismo normal.

Las enzimas desempeñan un papel importante en el metabolismo porque catalizan la conversión de una molécula en otra durante procesos metabólicos. Cuando una enzima metabólica es defectuosa o está presente en una cantidad anómala en un individuo, puede producirse como resultado un trastorno metabólico. Los trastornos metabólicos se deben con frecuencia a la herencia genética que conduce a ausencia o sobreproducción de una enzima o producción de una enzima defectuosa.

Como ejemplo, las deficiencias producidas por un gen inactivo pueden impedir que el organismo produzca una enzima (o enzimas) necesaria para descomponer determinados aminoácidos o tipos de grasas. Una deficiencia enzimática de este tipo impide normalmente el metabolismo normal de un nutriente, provocando que el nutriente o su metabolito se acumule en el organismo hasta niveles tóxicos. Una deficiencia enzimática también puede provocar deficiencias de nutrientes cuando una enzima no puede producir un producto final normal de un proceso metabólico. Las deficiencias de nutrientes resultantes de trastornos metabólicos pueden conducir a una alteración del crecimiento y el desarrollo, y otros problemas graves de salud.

Se conocen diversos métodos de análisis y examen para detectar enfermedades.

Se describen aplicaciones de examen clínico para enfermedades hereditarias usando espectrometría de masas en tándem por Rashed M. S. en "Clinical applications of tándem mass spectrometry: ten years of diagnosis and screening for inherited metabolic diseases", Journal of Chromatography B, vol. 758, 21, páginas 27-48. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

En el documento US 6.258.65 se dan a conocer métodos para examinar a recién nacidos usando espectrometría de masas en tándem por electropulverización para la detección de metabolitos. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

En el documento US 5.719.35 se dan a conocer métodos para someter a ensayo la actividad de enzimas y detectar una lectura fluorescente. En ese documento no se describen la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

Se dan a conocer diversos análisis de metabolitos de biotina por IM W. B., et al. en "Bacterial Degradation of Biotin", J. Biol. Chem., vol. 248, n.° 22, 1973, páginas 7798-785. La divulgación se limita a mostrar "espectros de masas de ásteres metílicos del catabolito 2-B-1 y d-bisnorbiotina" en la figura 6.

En el documento US 6.455.321 se dan a conocer métodos de examen de recién nacidos usando espectrometría de masas en tándem por electropulverización para la detección de metabolitos. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

En el documento US 5.629.21 se da a conocer una prueba de examen rápido para detectar el síndrome de Smith- Lemli-Opitz. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

En el documento US 6.67.194 se da a conocer un análisis cuantitativo rápido de proteínas o función de proteínas en mezclas complejas. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

Se dan a conocer ensayos de SIM específicamente diseñados para HMG-CoA reductasa en microsomas de hígado de rata purificados por M. Galli-Kienle ef al. en "Evaluation of enzyme activities by gas chromatography-mass spectrometry: HMGCoA reducíase and cholesterol 7a-hydrolase" Journal of Chromatography, vol. 289, 1984, páginas 267-276. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

Se dan a conocer ensayos de actividad aldehido deshidrogenasa de levadura purificada por L. M. Benson et al. en "Simultaneous structure-activity determination of disulfiram photolysis producís by on-line continuous-flow liquid secondary ion mass spectrometry and enzyme inhibition assay", Journal of chromatography, vol. 693, 1995, páginas

162-166. El documento no da a conocer la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y nivel de analitos.

Muchos trastornos metabólicos hereditarios son mortales en las primeras semanas o meses de vida postnatal, por ejemplo, defectos graves en la conversión de piruvato en acetil-coenzima A (CoA), algunos defectos en el ciclo de la urea, y defectos graves en el procesamiento de la fructosa. Los lactantes y niños con un trastorno metabóllco tratable se identifican con frecuencia mediante examen de recién nacidos en países desarrollados. Por ejemplo, las pruebas para detectar fenilcetonuria es una práctica rutinaria en países desarrollados. La fenilcetonuria es un ejemplo de un trastorno metabólico hereditario relativamente común que se produce en aproximadamente uno de cada 16. nacimientos vivos en los Estados Unidos. Los individuos que tienen fenilcetonuria no producen la enzima necesaria para descomponer la fenilalanina (un aminoácido). Afortunadamente, cuando se reconoce, este trastorno metabólico puede tratarse satisfactoriamente mediante restricción de la dieta.

Desafortunadamente, no se examina normalmente a los recién nacidos para detectar otros trastornos metabólicos tales como homocisteinuria, enfermedad de orina con olor a jarabe de arce, trastornos de ácidos orgánicos y trastornos de oxidación de ácidos grasos. Como resultado, con frecuencia estos trastornos se detectan en lactantes y niños tras haberse producido el daño y resultan evidentes efectos tales como retraso en el desarrollo y retraso mental. Sin embargo, con frecuencia tales efectos pueden reducirse o evitarse con una detección temprana y restricción de la dieta sostenida. Tal detección temprana implica examinar una muestra de sangre para detectar una actividad de enzimas o un marcador metabólico (un metabolito).

No se ha dispuesto de pruebas para recién nacidos extendidas para detectar múltiples trastornos metabólicos hereditarios debido, en parte, al coste asociado con cada prueba. Un enfoque para reducir los costes es examinar actividades de múltiples enzimas y metabolitos y en una única prueba. Sin embargo, el desarrollo de pruebas de múltiples enzimas/metabolitos se ha visto dificultado por las diferentes condiciones necesarias para las pruebas de enzimas en comparación con las pruebas de metabolitos. En la actualidad, no pueden llevarse a cabo pruebas de enzimas y metabolitos simultáneamente a partir de una única muestra de paciente.

Por tanto, existe la necesidad de métodos para diagnosticar eficazmente un trastorno metabólico en un individuo. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar un trastorno metabólico en un individuo.

El método implica (a) poner en contacto una muestra para determinar la presencia de (i) una o más enzimas metabólicamente indicativas que tienen una actividad alterada como resultado de un trastorno metabólico y (ii) uno o más analitos metabólicos, que tienen una cantidad alterada como resultado de un trastorno metabólico, con uno o más sustratos para dicha una o más enzimas para producir una mezcla de reacción, en condiciones en las que al menos una de dichas enzimas puede actuar sobre un sustrato correspondiente para generar al menos un producto; (b) poner en contacto dicha mezcla de reacción con un reactivo que inhibe la capacidad de dicha una o más enzimas para actuar sobre un sustrato correspondiente, en el que dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto son solubles en dicho reactivo; para producir una muestra de prueba y (c) determinar la cantidad o presencia de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto contenidos en dicha muestra de prueba... [Seguir leyendo]

Método para detectar un trastorno metabólico, que es un trastorno de la oxidación de ácidos grasos, trastorno de aciduria orgánica, aminoacidopatía o un trastorno indicado en la tabla 1 en un individuo, que comprende la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y niveles de metabolltos, caracterizado por:

(a) poner en contacto una muestra para determinar la presencia de

(i) una o más enzimas metabólicamente indicativas que tienen una actividad alterada como resultado de un trastorno metabólico y

(¡i) uno o más analitos metabólicos, que tienen una cantidad alterada como resultado de un trastorno metabólico,

con uno o más sustratos para dicha una o más enzimas para producir una mezcla de reacción, en condiciones en las que al menos una de dichas enzimas puede actuar sobre un sustrato correspondiente para generar al menos un producto;

(b) poner en contacto dicha mezcla de reacción con un reactivo que inhibe la capacidad de dicha una o más enzimas para actuar sobre un sustrato correspondiente, en el que dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto son solubles en dicho reactivo; para producir una muestra de prueba y

(c) determinar la cantidad o presencia de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto contenidos en dicha muestra de prueba usando espectrometría de masas,

en el que una cantidad o presencia determinada de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto se correlaciona con la presencia o ausencia de dicho trastorno metabólico.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de líquidos corporales.

Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de líquidos corporales es sangre.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra está seca.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo es un ser humano que se sospecha que tiene un trastorno metabólico.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo es un neonato.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo es un recién nacido.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo es un niño.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo es un adulto.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho trastorno metabólico es una metabolopatía congénita.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho trastorno metabólico es un trastorno metabólico adquirido.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha enzima metabólicamente indicativa se selecciona del grupo que consiste en oxidorreductasa, hidrolasa, Nasa, transferasa, ligasa e isomerasa.

Método según la reivindicación 12, en el que la enzima es una hidrolasa.

Método según la reivindicación 13, en el que la enzima es una biotinidasa.

Método según la reivindicación 14, en el que dicho sustrato es biocitina.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho analito metabólico es uno o más aminoácidos.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho analito metabólico es una acilcarnitina o pluralidad de acilcarn ¡tinas.

Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende además poner en contacto dicha muestra con uno o más sustratos de referencia.

Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende además poner en contacto dicha muestra con uno o más productos de referencia.

Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (d) comprende además, antes de la determinación,

22.

23.

24.

26.

27.

28.

29.

31.

32.

añadir uno o más productos de referencia correspondientes al al menos un producto.

Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (d) comprende además, antes de la determinación, añadir uno o más analitos de referencia correspondientes al uno o más analitos metabólicos contenidos en dicha muestra.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción es acuosa.

Método según la reivindicación 22, en el que dicho reactivo no es acuoso.

Método según la reivindicación 23, en el que dicho reactivo comprende un disolvente orgánico.

Método según la reivindicación 23, en el que dicho reactivo comprende un alcohol.

Método según la reivindicación 25, en el que dicho reactivo es metanol.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha espectrometría de masas es espectrometría de masas en tándem.

Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más sustratos están presentes en forma seca en un recipiente.

Método según la reivindicación 1, en el que se pone en contacto la mezcla de reacción con uno o más productos de referencia y uno o más analitos de referencia y se determina la cantidad de dicho uno o más analitos metabólicos y dicho al menos un producto contenidos en dichas muestras de prueba con respecto a dicho uno o más productos de referencia y dicho uno o más analitos de referencia, usando espectrometría de masas.

Método según la reivindicación 1, en el que se separa la muestra en dos partes de muestra y se somete cada parte de muestra a (a) y (b);

se combinan las dos mezclas de reacción para producir una muestra de prueba; y se someten las mezclas de reacción combinadas a (c).

Método según la reivindicación 1, en el que se separa la muestra en dos partes de muestra, en el que (a) comprende poner en contacto cada parte de muestra con un recipiente individual, conteniendo cada recipiente dicho uno o más sustratos para dicha una o más enzimas en forma seca;

se somete cada parte de muestra a (b);

se combinan las dos mezclas de reacción para producir una muestra de prueba; y se someten las mezclas de reacción combinadas a (c).

Método según la reivindicación 28, en el que se pone en contacto dicho recipiente con una disolución para generar dichas condiciones en las que al menos una de dichas enzimas puede actuar sobre un sustrato correspondiente para generar al menos un producto.