Detección de polimorfismos basada en amplificación.

Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana sospechosa de tener deleciones o inserciones de una base sencilla o múltiple en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación que comprenden una polimerasa, un par de cebadores y una sonda para formar una mezcla de reacción;

(b) realizar un ciclo que comprende las etapas de:

(i) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura por encima de 90 ºC suficientes para disociar las secuencias de ácido nucleico bicatenario,

(ii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y durante una temperatura de 45 ºC a 65 ºC para permitir que los cebadores y sonda hibriden con el ácido nucleico y formen de este modo híbridos de cebadores e híbridos de sondas;

(iii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura al menos 1 ºC por encima de la temperatura en (ii), suficientes para disociar los híbridos de sondas, si la sonda no es completamente complementaria del ácido nucleico y

(iv) aumentar la temperatura de la mezcla de reacción a una temperatura suficiente para activar la polimerasa,

(c) realizar de forma repetida el ciclo de la etapa (b) para formar un producto de amplificación; y

(d) detectar el producto de amplificación como un indicio de la presencia de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de ensayo.

Detección de polimorfismos basada en amplificación Campo técnico La presente invención se refiere a polimorfismos de ácidos nucleicos y, en particular, se refiere a analizar polimorfismos usando tecnología de amplificación de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención Estudios diseñados para determinar la secuencia del genoma humano, así como estudios diseñados para comparar secuencias genómicas humanas, han proporcionado información con respecto a polimorfismos de tales secuencias. Se ha descrito previamente una amplia diversidad de polimorfismos en el genoma humano. Los diversos tipos de polimorfismos genéticos humanos incluyen sustituciones, inserciones o deleciones de base sencilla; números variables de repeticiones en tándem; deleciones de todo o una gran parte de un gen; amplificaciones génicas; y reordenamientos cromosómicos.

El citocromo P450 (CYP) es una familia, o grupo, de genes en el genoma humano que codifica enzimas, varias de las cuales facilitan el metabolismo de diversos fármacos. Uno de estos genes, CYP2D6, desempeña un papel en el metabolismo de un gran número de fármacos, incluyendo varios productos usados para tratar trastornos psiquiátricos y cardiovasculares. No resulta sorprendente, por lo tanto, que se haya descubierto que algunas variantes del CYP2D6, al menos en parte, alteran la capacidad de un individuo para metabolizar fármacos.

Aunque algunos polimorfismos de CYP2D6 tienen poco efecto en la capacidad de un individuo para metabolizar fármacos, otros tienen un efecto significativo. Por ejemplo, una variante conocida como CYP2D6 asterisco cinco (CYP2D6*5, en lo sucesivo *5) comprende una deleción de la mayor parte del gen CYP2D6. *5 es una de varias variantes de CYP2D6 que pueden contribuir a un fenotipo metabolizador bajo, característico de personas que tienen una capacidad al menos alterada para metabolizar ciertas clases de fármacos. Una posible consecuencia del fenotipo metabolizador bajo es que los fármacos, normalmente metabolizados por CYP2D6, pueden acumularse hasta concentraciones tóxicas en individuos metabolizadores bajos. Como alternativa, un fármaco que requiere activación por proteína CYP2D6 puede no ser eficaz en personas que tengan el fenotipo metabolizador bajo. Otras variantes que pueden contribuir a un fenotipo metabolizador bajo incluyen una sustitución de nucleótido sencillo (CYP2D6 asterisco 4 o CYP2D6*4, en lo sucesivo en este documento *4) y dos deleciones de nucleótido sencillo (CYP2D6 asterisco 3 o CYP2D6*3 en lo sucesivo en este documento *3; y CYP2D6 asterisco 6 o CYP2D6*6 en los sucesivo en este documento *6) .

Por otro lado, algunos individuos portan múltiples copias del gen de CYP2D6 (denominado de diversas formas "una amplificación" del gen CYP2D6 o CYP2D6x2, en lo sucesivo en este documento x2) en sus genomas. Los individuos con esta variante pueden tener una capacidad aumentada para metabolizar ciertas clases de fármacos y por lo tanto se eliminan dosis normales de estos fármacos del cuerpo con bastante rapidez y tienen poca probabilidad de conseguir el efecto deseado. Otras variantes de CYP2D6 incluyendo CYP2D6 asterisco 2 (CYP2D6*2 en lo sucesivo en este documento *2) , una sustitución de nucleótido sencillo, y CYP2D6 asterisco 9 (CYP2D6*9 en lo sucesivo en este documento *9) , una deleción de tres nucleótidos, no han demostrado tener ningún efecto en la capacidad de un individuo para metabolizar fármacos. Por lo tanto, existen diversos y diferentes tipos de variantes de CYP2D6 que pueden o no alterar el metabolismo de fármacos en seres humanos.

Se han propuesto muchos métodos diferentes para detectar variantes tales como las mencionadas anteriormente. Desafortunadamente, sin embargo, han parecido necesarios previamente diferentes metodologías de detección para detectar diferentes tipos de variantes. Aunque los ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos para polimorfismos de nucleótido sencillo han usado tecnología que es susceptible de automatización, los ensayos basados en amplificación para detectar variaciones mayores tales como deleciones o inserciones grandes no son fácilmente susceptibles de automatización. Por ejemplo, "PCR específica de alelos" se describe en la Solicitud de Patente Europea 463 395 y es un método para detectar polimorfismos de nucleótido sencillo. Pueden realizarse ensayos basados en PCR específica de alelos usando metodologías que son relativamente fáciles de automatizar. Por otro lado, se ha empleado "PCR larga" para detectar inserciones o deleciones grandes de secuencias de ácidos nucleicos, particularmente *5 y x2 (Johansson l., Lundqvist E., Dahl M.L., y Ingelinan-Sundberg, Pharmacogenomics, 6, 351-355 (1996) ) . Aunque los productos de amplificación de PCR específica de alelos y PCR larga pueden detectarse en geles, los productos de PCR larga están limitados en cierto grado a la detección en gel. En consecuencia, las metodologías actuales requieren el uso de geles para detectar ciertos tipos de mutaciones.

Se sabe bien, sin embargo, que el procesamiento de geles consume tiempo y es por lo tanto caro. Además, no existe una plataforma sencilla que permita la detección de, por ejemplo, polimorfismos de base sencilla y deleciones grandes usando un formato sencillo que sea fácilmente susceptible de automatización. En consecuencia, existe la necesidad de medios para detectar productos de amplificación de múltiples y diferentes tipos de polimorfismos en una plataforma automática sencilla.

Johansson 1. et al.: "PCR-based genotyping for duplicated and deleted CYP2D6 genes", Pharmacogenetics vol. 6, nº 4, 1996, páginas 351-355, describen métodos basados en PCR para detección de alelos que tienen genes de CYP2D6 activos duplicados, multiplicados o delecionados, pudiendo usarse los métodos para genotipar individuos como metabolizadotes bajos, intermedios, rápidos, normales o ultrarrápidos.

Stüven T. et al.: "Rapid detection of CYP2D6 alleles by long-distance and multiplex-polymerase chain reaction", Pharmacogenetics, vol. 6, nº 5, 1996, páginas 417-421, enseñan un procedimiento de genotipación de CYP2D6 rápido que comprende amplificación de más de un ácido nucleico diana en la misma mezcla de reacción de amplificación.

El documento EP-B-0 463 395 describe cebadores para la detección de genes para enzimas que metabolizan fármacos, especialmente para la detección de la presencia o ausencia de secuencias de nucleótidos mutadas dentro de los genes de "metabolizadores bajos" de fármacos.

El documento WO 98/48052 describe un método basado en amplificación para detectar secuencias de ácidos nucleicos mutantes.

El documento WO 97/32040 proporciona un sistema de detección para su uso en un método para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico predeterminada en una muestra de ácido nucleico.

Roberts R. et al.: "Rapid and Comprehensive Determination of Cytochrome P450 CYP2D6 Poor Metabolizer Genotypes by Multiplex Polymerase Chain Reaction", Human Mutation, vol 16, 2000, páginas 77-85, describe un método de sistema de mutación refractario de amplificación múltiple (ARMS) basado en PCR, que identifica simultáneamente algunos alelos del gen CYP2D6.

Wetmur J.G. et al.: "DNA Probes: Applications of the Principies of Nucleic Acid Hybridization", Critical Reviews in Biochemistr y and Molecular Biology, vol. 26 (3/4) , 1991, páginas 227-259, describen aspectos cuantitativos de termodinámica y cinética de hibridación de ácidos nucleicos, y la síntesis o biosíntesis y la detección de sondas marcadas, con un análisis de sus límites de sensibilidad y especificidad.

Breve descripción de la invención Se proporcionan en este documento métodos capaces de analizar secuencias de ácido nucleico polimórficas de una manera adecuada para automatización. Los métodos son particularmente adecuados para detectar secuencias de ácido nucleico que tengan una variante que sea una deleción o inserción grande. Típicamente, tales variaciones estarán en el orden de cincuenta nucleótidos o más. Provechosamente, los métodos para detectar tales secuencias de ácidos nucleicos variantes son fácilmente susceptibles de automatización y se incorporan fácilmente a un panel de ensayos que analizan múltiples tipos de polimorfismos genéticos.

De acuerdo con un método, la presencia de una deleción o una inserción en una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra de ensayo comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación y un conjunto... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana sospechosa de tener deleciones o inserciones de una base sencilla o múltiple en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: 5

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación que comprenden una polimerasa, un par de cebadores y una sonda para formar una mezcla de reacción;

(b) realizar un ciclo que comprende las etapas de:

(i) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura por encima de 90 º C suficientes para disociar las secuencias de ácido nucleico bicatenario, (ii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y durante una temperatura de 45 º C a 65 º C para permitir que los cebadores y sonda hibriden con el ácido nucleico y formen de este modo híbridos de cebadores e híbridos de sondas;

(iii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura al menos 1 º C por encima de la temperatura en (ii) , suficientes para disociar los híbridos de sondas, si la sonda no es completamente complementaria del ácido nucleico y (iv) aumentar la temperatura de la mezcla de reacción a una temperatura suficiente para activar la polimerasa, 20

(c) realizar de forma repetida el ciclo de la etapa (b) para formar un producto de amplificación; y

(d) detectar el producto de amplificación como un indicio de la presencia de la secuencia de ácido nucleico en la muestra de ensayo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico polimórfica.

3. Un método para determinar si una deleción o inserción de al menos 50 pares de bases está presente en el ADN

en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: 30

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación, comprendiendo los reactivos de amplificación cebadores de amplificación, una sonda y una polimerasa, para formar una mezcla de reacción en la que el conjunto de cebadores de amplificación hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico convencional en la muestra de ensayo;

(b) someter la mezcla de reacción a condiciones de amplificación para formar un producto de amplificación de secuencia de ácido nucleico diana y un producto de amplificación de ácido nucleico convencional, comprendiendo las condiciones de amplificación las etapas de:

(i) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura por encima de 90 º C 40 suficientes para disociar las secuencias de ADN bicatenarias, (ii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y durante una temperatura de 45 º C a 65 º C para permitir que las sondas y los cebadores de amplificación hibriden con el ADN y formar de este modo híbridos de cebadores e híbridos de sondas;

(iii) mantener la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura al menos 1 º C por 45 encima de la temperatura en (ii) suficientes para disociar los híbridos de sondas, si la sonda no es completamente complementaria del ADN;

(iv) aumentar la temperatura de la mezcla de reacción a una temperatura suficiente para activar la polimerasa;

50 (c) detectar los híbridos de sondas de amplificación de secuencia de ácido nucleico diana;

(d) detectar los híbridos de sondas de amplificación de ácido nucleico convencional; y

(e) comparar los híbridos de sondas de amplificación de secuencia de ácido nucleico diana con los híbridos de sondas de amplificación de ácido nucleico convencional para determinar si está presente una deleción o inserción de al menos 50 pares de bases en el ADN en la muestra de ensayo.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la deleción o inserción es de al menos 200 pares de bases.

5. El método de la reivindicación 3, en el que la deleción o inserción es de al menos 1000 pares de bases.

60 6. El método de la reivindicación 3, en el que la inserción o deleción está en el locus de CYP2D6.