Detección de displasia de alto grado en células del cuello uterino.

Un procedimiento para cribar displasia de alto grado en un sujeto,

procedimiento que comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende el grupo de sondas para los loci específicos 8q24, 3q26, Xp22 y CEP15 que puede detectar selectivamente displasia de alto grado en la muestra biológica en condiciones suficientes para permitir la hibridación de las sondas con cromosomas en la muestra, si los hay; y

(b) detectar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas con la muestra biológica para determinar si el sujeto tiene displasia de alto grado.

Detección de displasia de alto grado en células del cuello uterino Antecedentes de la invención El cáncer de cuello uterino sigue siendo uno de los tipos de cáncer más comunes que afectan a mujeres en todo el mundo. La ruta biológica para el carcinoma de cuello uterino empieza con células intraepiteliales normales y se desarrolla mediante displasia de bajo y luego de alto grado antes de que se obtenga el tumor maligno. Los citólogos caracterizan el paso a tumor maligno como la progresión de células epiteliales normales a células escamosas atípicas de significancia indeterminada (ASCUS) a lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LIEB) y luego lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (LIEA) antes del carcinoma in situ y finalmente resultado de tumor maligno. Los histólogos caracterizan la progresión de células normales a diversos grados de neoplasia intraepitelial de cuello uterino (NICU I, II y III) , luego a carcinoma in situ y finalmente tumor maligno. NICU I se considera displasia de bajo grado comparable a LIEB. NICU II y III se consideran displasia de alto grado comparables a LIEA.

El presente tratamiento de referencia incluye regular pruebas citológicas con un frotis de Papanicolaou (Pap) para identificar anomalías que indiquen displasia o carcinoma en células de la paciente. Si se detecta displasia de alto grado y se confirma por examen histológico, la zona de transformación del cuello uterino de la paciente se extirpa inmediatamente por escisión con asa o biopsia de cono. Se requieren procedimientos más radicales cuando se detecta el carcinoma. Al mismo tiempo, sin embargo, la progresión de tumor normal a maligno no es estricta y la presencia de displasia de bajo grado no indica necesariamente que la paciente progresará a displasia de alto grado o tumor maligno. Significativamente, el valor predictivo negativo de los procedimientos citológicos (por ejemplo, frotis de Pap) para detectar displasia de alto grado es escaso. Por tanto, la displasia de bajo grado puede diagnosticarse erróneamente como de alto grado, sometiendo así a la paciente a tratamiento injustificado y la displasia de alto grado puede diagnosticarse erróneamente como displasia de bajo grado, retrasando así el tratamiento apropiado. Por consiguiente, existe la necesidad de un procedimiento de diagnóstico que distinga con exactitud entre displasia de bajo y de alto grado.

Los especímenes de pacientes normalmente comprenden muchos miles de células para la evaluación. El diagnóstico basado en la evaluación de células individuales puede requerir mucho tiempo y ser tedioso para los técnicos que lo realizan debido al gran número de células que se requieren para la evaluación. Por tanto, existe la necesidad de un medio para simplificar un procedimiento de evaluación de células.

Otros han observado que las anomalías genéticas (por ejemplo, cambios en las regiones del cromosoma o cambios en niveles de ploidez) acompañan la progresión de células normales a tumor maligno del cuello uterino. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.919.624 a Ried y col. Ried y col. observaron que las anomalías cromosómicas pueden usarse para clasificar la progresión de células del cuello uterino displásicas en estadios tardíos, por ejemplo, de carcinoma de cuello uterino no invasivo a invasivo. Todavía otros han demostrado que el cáncer de cuello uterino está asociado a infección por ciertos tipos de virus del papiloma humano (VPH) , particularmente los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 35 y 42. Véase, por ejemplo, Lazo, Brit. J. Cancer, (1999) 80 (12) , 2008-2018. Adicionalmente, muchas proteínas del ciclo celular tales como p16 y ciclina E y marcadores de proliferación celular tales como las proteínas Ki67 y PCNA también son conocidos por ser altamente activos en células neoplásicas. Por tanto, las células que contienen cantidades anormales de estos marcadores se han sugerido como buenos candidatos para células que pueden progresar a tumor maligno.

Zhang y col., Int. J. Cancer, 101, 427-433 (2002) , desvelan que la frecuente amplificación de bajo nivel de los oncogenes PIK3CA, TERT, C-MYC, CCND1, ERBB2 y el locus 20q13.2 se detectó en cánceres de cuello uterino primarios asociados a VPH, y una combinación de estas alteraciones frecuentemente produjo tumores avanzados. Woenckhaus y col., J. Pathology, 198, 335-342 (2002) , desvelan que la ganancia oncogénica de PIK3CA y el aumento de la expresión de la subunidad catalítica p110α de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) están asociados a progresión de displasia en carcinoma de células escamosas.

La solicitud PCT WO 0024760 describe procedimientos y reactivos para detectar ADN del VPH en frotis de Pap usando hibridación in situ y microscopia de campo brillante. La sonda consiste en sondas de ADN de longitud completa del VPH-16, -18, -31, -33, -35 y -51. La patente reivindica que esta mezcla de sondas detecta otros tipos de VPH de alto riesgo, pero no VPH de bajo riesgo. La capacidad de la mezcla de sondas para el VPH desvelada para prevenir la hibridación con tipos de VPH de bajo riesgo se logra por la modulación de las cantidades de cada ADN del VPH incluidas en la mezcla de sondas. Las sondas para el VPH desveladas son diferentes de las descritas en este documento. Además, los ensayos de la invención modulan la hibridación cruzada de sondas reduciendo la rigurosidad de las condiciones de hibridación a la vez que mantienen las concentraciones de sonda constantes para todos los tipos. La presente solicitud tampoco combina la sonda para el VPH con el uso de sondas cromosómicas para detectar anomalías de cromosomas en las células infectadas por el VPH.

Hopman y col. (J of Pathology 2004; 202:23-33) analizaron el estado del VPH y las aberraciones cromosómicas en secciones de biopsias del cuello uterino por FISH. Este trabajo sólo usó sondas para VPH-16 y VPH-18 y sondas

genómicas para el cromosoma 1 (1q12) , 17 y X. A diferencia del ensayo inventivo que detecta simultáneamente VPH y ganancias cromosómicas en las mismas células, la detección de Hopman y col. de células positivas para el VPH y las aberraciones cromosómicas se realizaron en secciones de tejido paralelas.

Hasta la fecha, los solicitantes no conocen ninguna publicación que haya demostrado que cualquier anomalía cromosómica con o sin la presencia de otro marcador puede usarse para distinguir displasia de bajo grado de displasia de alto grado o haya combinado un procedimiento de diagnóstico tal con la asociación conocida del VPH y cáncer de cuello uterino.

Sumario de la invención La invención se basa en el descubrimiento de que ciertas anomalías cromosómicas pueden usarse para detectar selectivamente neoplasia intraepitelial del cuello uterino de alto grado (NICU II y NICU III) y carcinoma maligno en especímenes de biopsia del cuello uterino y de frotis de Pap sin detectar neoplasia intraepitelial del cuello uterino de bajo grado. El procedimiento puede detectar neoplasia intraepitelial del cuello uterino de alto grado (NICU II y NICU III) y carcinoma maligno a altos niveles de sensibilidad y especificidad, es decir, aproximadamente el 95% de cada una. La invención se basa en el uso de tecnología de hibridación in situ en el que se permite que sondas de ácido nucleico marcadas se hibriden con muestras del cuello uterino. Preferentemente se usa hibridación in situ fluorescente (FISH) y las sondas de ácido nucleico son sondas de ADN que están fluorescentemente marcadas. Entonces, los resultados de hibridación guardan relación con un diagnóstico clínico de neoplasia intraepitelial del cuello uterino de alto grado (NICU II y NICU III) y carcinoma maligno.

La invención proporciona primero un procedimiento para cribar displasia de alto grado en un sujeto que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende el grupo de sondas para los loci específicos 8q24, 3q26, Xp22 y CEP15 que puede detectar selectivamente displasia de alto grado en la muestra biológica en condiciones suficientes para permitir la hibridación de las sondas con cromosomas en la muestra, si los hay, y (b) detectar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas con la muestra biológica para determinar si el sujeto tiene displasia de alto grado. Algunas realizaciones de este procedimiento se definen en las reivindicaciones adjuntas 2-9. La presente invención también proporciona un procedimiento para cribar displasia de alto grado en un sujeto que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende el grupo de sondas para... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para cribar displasia de alto grado en un sujeto, procedimiento que comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende el grupo de sondas para los loci específicos 8q24, 3q26, Xp22 y CEP15 que puede detectar selectivamente displasia de alto grado en la muestra biológica en condiciones suficientes para permitir la hibridación de las sondas con cromosomas en la muestra, si los hay; y

(b) detectar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas con la muestra biológica para determinar si 10 el sujeto tiene displasia de alto grado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende una muestra de biopsia del cuello uterino, frotis del cuello uterino o legrado del cuello uterino.

15 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las sondas cromosómicas están fluorescentemente marcadas.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que células de la muestra biológica se criban previamente para un marcador asociado a riesgo para cáncer.

20 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células de la muestra biológica se criban previamente para infección por el VPH.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la muestra se criba para infección por uno o más de los tipos del VPH de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 y 58. 25

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células de la muestra biológica se criban previamente para la presencia de una proteína del ciclo celular o un marcador de proliferación celular.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la proteína del ciclo celular es p16 o ciclina E. 30

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el marcador de proliferación celular es la proteína Ki67 o la proteína PCNA.

10. Un procedimiento para cribar displasia de alto grado en un sujeto, procedimiento que comprende: 35

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende el grupo de sondas para los loci específicos 3q26, 8q24 y el centrómero del cromosoma 8 y con una mezcla de sondas para el VPH en condiciones suficientes para permitir la hibridación de las sondas con cromosomas en la muestra, si los hay, y suficientes para permitir la detección de células infectadas por el VPH presentes en la muestra, si las hay;

(b) detectar la presencia de células infectadas por el VPH en la muestra; y

(c) determinar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas en las células infectadas por el VPH en la muestra para determinar si el sujeto tiene displasia de alto grado.

45 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la mezcla de sondas para el VPH comprende sondas sustancialmente complementarias a la secuencia codificante completa para cada uno de VPH-16, VPH-18, VPH-30, VPH-45, VPH-51 y VPH-58.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las condiciones de hibridación son suficientes para detectar la 50 presencia de cualquiera de VPH-31, VPH-33; VPH-35, VPH-39, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-26, VPH53 y VPH-66.