Un péptido ramificado multimérico consistente en:

- una estructura nuclear de MAP;

- un péptido lineal consistente en una secuencia aminoacídica de al menos 10 aa comprendida en la secuencia 5 de SEQ ID No.2, unido mediante un enlace carbamido con cada uno de los residuos aminoterminales de la estructura nuclear de MAP, en el que los péptidos lineales son iguales o diferentes entre sí.

Detección de anticuerpos anti-proteína P ribosómica mediante péptidos sintéticos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para la identificación de anticuerpos de diagnóstico en 5 enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistémico (LES) y, por lo tanto, herramientas útiles para el diagnóstico o tratamiento terapéutico de LES.

Estado de la técnica

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos contra componentes nucleares y contra proteínas ribosómicas. Se ha mostrado que los anticuerpos

contra los tres componentes proteicos de la subunidad ribosómica 60S, llamados P0, P1 y P2, están asociados específicamente con LES y se detectan más frecuentemente en la enfermedad activa, especialmente en pacientes con nefritis [K.B. Elkon et al., J. Exp. Med. 1985, 162, 459; A.M. Francoeur et al., J. Immunol. 1985, 135, 2378; E. Bonfa et al., N. Engl. J. Med. 1987, 317, 265]. Los anticuerpos anti-P ribosómica se identificaron en sueros de pacientes de LES mediante análisis de inmunotinción en extractos ribosómicos.

Se ha verificado que el determinante antigénico de las proteínas P ribosómicas está localizado en la región Cterminal de la proteína ribosómica eL12 del organismo Artemia salina [K. Elkon el al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 7419]. Se ha demostrado que un procedimiento basado en el uso de un péptido que comprende los 22 últimos aminoácidos (C-22: H-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Asp-Met-Gly-Phe-Gly-LeuPhe-Asp-OH, SEQ ID No.1) [N. Brot et al., US4865970] detecta autoanticuerpos específicos de LES en

aproximadamente un 10-20% de los sueros de pacientes [K. Elkon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5186;

F.B. Karassa et al., Arthritis Rheum. 2006, 54, 312]. La sensibilidad del ELISA basado en el péptido C-22 mejoró adicionalmente usando el péptido antigénico múltiple de cuatro ramas (MAP) de C-22 [B.F. Bruner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005, 1051, 390] o los últimos 13 aminoácidos C-terminales [L. Caponi et al., J. Immunol. Methods 1995, 179, 193]. No obstante, se han efectuado algunos estudios para identificar epítopos conformacionales [E. Koren et 25 al., J. Clin. Invest. 1992, 89, 1236; M. Mahler et al., Clin. Vaccine Immunol. 2006, 13, 77] o diferentes regiones epitópicas de proteínas P ribosómicas [N. Fabien et al., J. Autoimmun. 1999, 13, 103]. Un examen peptídico por las secuencias aminoacídicas completas de P0, P1 y P2 humanas confirmó la inmunodominancia reseñada del epítopo C-terminal [M. Mahler et al., J. Mol. Med. 2003, 81, 194]. No se demostró que péptidos centrales o N-terminales fueran más activos que C-22 en las condiciones de ensayo. Una cartografía epitópica adicional, efectuada sobre la

secuencia completa de la proteína ribosómica P0 humana, demostró la presencia de otras regiones antigénicas menos activas que C-22 [B.F. Bruner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005, 1051, 390].

Descripción de la invención

Es un problema técnico aún no resuelto por la técnica anterior la provisión de herramientas de diagnóstico específicas y fiables para enfermedades autoinmunitarias, específicamente LES.

La presente invención se refiere al uso de péptidos derivados de la porción N-terminal de la proteína ribosómica P1, que sorprendentemente detectan autoanticuerpos específicos en sueros de pacientes de LES. Además, es otra realización de la presente invención el desarrollo de un procedimiento basado en péptidos más sensible de detección de LES. Los péptidos de la presente invención, también conjugados con una resina, pueden usarse para tratamientos terapéuticos de pacientes de LES.

Los autores efectuaron una cartografía epitópica completa de las secuencias de las proteínas P1 y P2 humanas. Se sintetizaron 14 péptidos de 20 aminoácidos con una superposición de 5 aminoácidos que comprende las regiones Nterminales. Se obtuvieron los péptidos como productos puros (pureza >95%) y se ensayaron en 25 sueros de pacientes de LES y 68 donantes de sangre sanos.

Se ha encontrado sorprendentemente, y es objeto de la presente invención, que un péptido derivado de la región N

45 terminal de la proteína P1 ribosómica, de 10-20 aminoácidos, tiene un papel muy eficaz en el reconocimiento de autoanticuerpos típicos de enfermedades autoinmunitarias y es por lo tanto una herramienta útil para el diagnóstico

o tratamiento terapéutico de LES.

Es un objeto de la invención un péptido ramificado multimérico consistente en:

- una estructura nuclear de MAP;

50 -un péptido lineal consistente en una secuencia aminoacídica de al menos 10 aa comprendida en la secuencia de SEQ ID No.2, unido mediante un enlace carbamido con cada uno de los residuos aminoterminales de la estructura nuclear de MAP, en el que los péptidos lineales son iguales o diferentes entre sí.

Según la invención, una estructura nuclear de MAP es: en la que X es un aminoácido que tiene al menos dos residuos aminofuncionales, Y es un aminoácido seleccionado del grupo de alanina, glicina o arginina, m es 0 o 1, n1, n2, n3 y n4 son números enteros comprendidos entre 0 y 10 y en la que los enlaces son enlaces carbamido.

Como es conocido por la bibliografía científica [J.P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5409], la estructura de MAP se caracteriza por un núcleo aminoacídico inmunológicamente inerte, generalmente un núcleo ramificado de lisina o de lisina y alanina, al que se unen una serie de copias idénticas de la secuencia antigénica de interés, generalmente 4 u 8 copias. La expresión “núcleo inmunológicamente inerte” significa que, cuando se usan MAP como inmunógenos, no inducen la producción de anticuerpos dirigidos contra el núcleo aminoacídico central.

Preferiblemente, el péptido ramificado multimérico es un péptido ramificado tetramérico y los péptidos lineales consisten en una secuencia aminoacídica perteneciente al siguiente grupo: aa 1-20 de la SEQ. ID No.2; aa 1-10 de la SEQ. ID No.2; aa 6-16 de la SEQ ID No. 2; aa 11-20 de la SEQ ID No.2, como en el esquema siguiente:

Preferiblemente, el MAP comprende 4 copias idénticas de los péptidos anteriormente reseñados. Con detalle, se 15 prefieren los siguientes MAP que contienen las secuencias aminoacídicas anteriores:

Es otro objeto de la invención una composición peptídica que comprende al menos un péptido ramificado multimérico como se da a conocer anteriormente y un péptido ramificado tetramérico adicional que comprende una estructura nuclear de MAP y 4 péptidos lineales que tienen la secuencia aminoacídica 10-22 de la SEQ ID No.1.

Es otro aspecto de la presente invención el desarrollo de un procedimiento de diagnóstico para aumentar la especificidad de los ensayos inmunológicos. El procedimiento de diagnóstico preferido se efectúa ensayando los péptidos 1-8 y el MAP de cuatro ramas de los últimos 13 aminoácidos C-terminales de la proteína ribosómica eL12 del organismo Artemia salina (SEQ ID. No.1: Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Asp-Met-Gly-Phe-Gly-LeuPhe-Asp) .

El péptido ramificado multimérico en formato MAP tiene la siguiente estructura: El uso combinado de las dos regiones antigénicas diferentes permitió detectar la presencia y/o medir los niveles de anticuerpos anti-proteína P ribosómica en muestras de fluidos biológicos en un número aumentado de pacientes con LES.

El ensayo inmunológico basado en los péptidos preferidos comprendidos en la SEQ. ID No. 1 y en el MAP 5 tetramérico ramificado de fórmula 9 puede efectuarse... [Seguir leyendo]

1. Un péptido ramificado multimérico consistente en:

- una estructura nuclear de MAP;

- un péptido lineal consistente en una secuencia aminoacídica de al menos 10 aa comprendida en la secuencia 5 de SEQ ID No.2, unido mediante un enlace carbamido con cada uno de los residuos aminoterminales de la estructura nuclear de MAP, en el que los péptidos lineales son iguales o diferentes entre sí.

2. El péptido ramificado multimérico según la reivindicación 1, que es un péptido ramificado tetramérico y que consiste en la secuencia aminoacídica de los péptidos lineales pertenecientes al siguiente grupo: aa 1-20 de la SEQ. ID No.2; aa 1-10 de la SEQ. ID No.2; aa 6-16 de la SEQ. ID No.2; aa 11-20 de la SEQ. ID No.2.

10 3. Una composición peptídica que comprende al menos un péptido de las reivindicaciones 1 a 2 y un péptido ramificado tetramérico que comprende una estructura nuclear de MAP y 4 péptidos lineales que tienen la secuencia aminoacídica 10-22 de la SEQ ID No.1.

4. Uso de un péptido consistente en una secuencia aminoacídica de al menos 10 aa comprendida en la secuencia de SEQ ID No.2 para la detección in vitro de autoanticuerpos específicos de una enfermedad autoinmunitaria.

15 5. Uso del péptido según la reivindicación 4, en el que dicho péptido consiste en una secuencia aminoacídica perteneciente al siguiente grupo: aa 1-20 de la SEQ. ID No.2; aa 1-10 de la SEQ. ID No.2; aa 6-16 de la SEQ. ID No.2; aa 11-20 de la SEQ. ID NO.2.

6. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido está unido a un soporte sólido.

20 7. Un kit de inmunodiagnóstico para detectar autoanticuerpos específicos de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende como reactivo selectivo el péptido o la composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. El kit de inmunodiagnóstico según la reivindicación 7, en el que la enfermedad autoinmunitaria es LES.

9. Un procedimiento para detectar autoanticuerpos específicos de una enfermedad autoinmunitaria en una muestra

de fluido, que comprende la etapa de incubar dicha muestra de fluido con el péptido o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 precedentes, y detectar los anticuerpos unidos.

10. El procedimiento para detectar autoanticuerpos según la reivindicación 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria es LES.

11. Un péptido según las reivindicaciones 1 a 3 para uso médico.