Procedimiento para controlar la proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras.

Una población de células madre hematopoyéticas expandida obtenida por cultivo ex vivo de células madre yprogenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal sembradas en un medio de cultivo queproporciona a dichas células madre condiciones para proliferación celular y en presencia de tetraetilenpentamina(TEPA),

en la que dicho medio de cultivo comprende citocinas de actuación temprana; y

en la que dicha TEPA y dichas condiciones de proliferación dan como resultado (i) mayor proliferación de célulasmadre prolongada; (ii) mayor expansión a largo de plazo de células clonogénicas; y (iii) mantenimiento de un mayorporcentaje de células madre de sangre del cordón umbilical indiferenciadas en su estado indiferenciado encomparación con células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical cultivadas en presencia de dichascondiciones de proliferación y en ausencia de TEPA,

inhibiendo de este modo la diferenciación, permitiendo a la vez la expansión de dicha población de células madre yprogenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical en dicho medio de cultivo,

y en la que dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical por lo tanto seexpanden pero no se diferencian más en comparación con células madre de sangre del cordón umbilical sembradasex vivo de las que se expandió dicha población de células madre y progenitoras hematopoyéticas expandida.

Procedimiento para controlar la proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para controlar la proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para imponer proliferación pero restringir la diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal tratando con quelantes o metales de transición, dando como resultado reducción en disponibilidad de metales de transición.

Diferenciación y proliferación celular

La producción normal de células sanguíneas (hematopoyesis) implica los procesos de proliferación y diferenciación que están estrechamente relacionados. En la mayoría de las células hematopoyéticas después de la división en las células descendientes experimentan una serie de cambios progresivos que con el tiempo culminan en células sanguíneas funcionales completamente diferenciadas (maduras) , que en su mayor parte están desprovistas del potencial proliferativo.

Por lo tanto, el proceso de diferenciación limita, y con el tiempo detiene, la división celular. Solamente en una pequeña minoría de las células hematopoyéticas, conocidas como células madre, la división celular puede dar como resultado descendencia que sea similar o idéntica a sus células parentales. Este tipo de división celular, conocida como autorrenovación, es una propiedad inherente de las células madre y ayuda a mantener un pequeño grupo de células madre en su estado más indiferenciado. Algunas células madre pierden su capacidad de autorrenovación y después de la división celular se diferencian en diversos tipos de progenitores comprometidos con un linaje que finalmente dan lugar a células maduras. Mientras que estas últimas proporcionan la capacidad funcional del sistema de células sanguíneas, las células madre son responsables del mantenimiento de la hematopoyesis a lo largo de la vida a pesar de una pérdida continua de las células más diferenciadas a través de apoptosis (muerte celular programada) y/o retirada activa de células maduras envejecidas por el sistema reticuloendotelial.

Como se detalla adicionalmente posteriormente, la expansión de las subpoblaciones de células madre y otras células linfohemopoyéticas definidas por cultivo ex vivo podría tener importantes aplicaciones clínicas.

Se ha sugerido una diversidad de protocolos y se han experimentado con respecto a enriquecimiento de tales poblaciones. Las estrategias experimentales principales incluyen incubación de células mononucleares con o sin selección de CD34+ (8) ; con diferentes cócteles de factores de crecimiento tempranos y tardíos (17) ; con o sin suero (7) ; en cultivos estacionarios, cultivos con intercambio de medio rápido (18) o en perfusión continua (biorreactores) (6) ; y con o sin capa de células del estroma establecida (19) .

Aunque se obtuvo con frecuencia una expansión significativa de progenitores intermedios y tardíos durante cultivos ex vivo de 7-14 días, la magnitud de células madre hematopoyéticas tempranas (CD34+CD38-) con alto potencial proliferativo, habitualmente disminuyó (6, 20-22) .

Por lo tanto, estos cultivos no dan como resultado verdadera expansión de células madre, sino más bien proliferación y diferenciación de las células madre en células preprogenitoras, acompañado de empobrecimiento del grupo de células madre primitivas.

Para conseguir expansión ex vivo máxima de células madre deberían cumplirse las siguientes condiciones: (I) la diferenciación debería inhibirse o retardarse de forma reversible y (ii) la autorrenovación debería prolongarse al máximo.

Papel del cobre en la diferenciación celular:

La posible implicación del cobre en desarrollo de células hemopoyéticas pudo inferirse a partir de los siguientes hallazgos:

Síntomas clínicos de deficiencia de Cobre: La deficiencia de cobre puede resultar de defectos hereditarios, tales como síndrome de Menkes o enfermedad Celiaca, o de afecciones adquiridas. Lo último se asocia típicamente con desnutrición. Puede causarse por nutrición parenteral total no complementada de Cobre (por ejemplo después de resección intestinal) , por consumo de altos niveles de Cinc, que interfiere en la utilización del Cobre, en neonatos con peso insuficiente y/o alimentados con leche de vaca (fuente escasa de Cobre) , que pueden dar como resultado casos graves de síndrome de Shwanchman. El tratamiento no equilibrado con quelantes de Cobre en casos de sobrecarga de Cobre tales como en enfermedad de Wilson también puede conducir a deficiencia de Cobre.

Los síntomas clínicos de deficiencia de Cobre pueden incluir alteración del crecimiento, desarrollo cerebral, fuerza y morfología ósea, contractilidad miocárdica, metabolismos del colesterol y la glucosa, mecanismos de defensa del huésped (inmune) y más.

Es de particular importancia para este estudio que la deficiencia de Cobre se asocia con frecuencia con anomalías hematológicas, incluyendo anemia, neutropenia y trombocitopenia. Ninguna de estas manifestaciones patológicas responde a terapia con hierro, pero se invierten rápidamente después de complementación con Cobre (27-28) .

El mecanismo por el que la deficiencia de Cobre conduce a neutropenia se desconoce. Entre las posibles causas, solas o en combinación, están: (i) muerte temprana de células progenitoras en la médula ósea (BM) ; (ii) formación alterada de neutrófilos a partir de células progenitoras en la BM; (iii) reducción de la tasa de maduración celular en la BM; (iv) liberación alterada de neutrófilos de la BM a la circulación; (v) tasa de eliminación potenciada de neutrófilos en circulación.

La examinación de la BM de pacientes deficientes en Cobre neutropénicos demuestra la ausencia de células maduras (“detención de maduración”) . Se ha mostrado que las células derivadas de tal BM no formaron colonias en medio semisólido que contenía suero deficiente en Cobre, pero conservaron el potencial de crecimiento de colonias normal en suero que contenía Cobre. Estos resultados indican la presencia de progenitores intactos en la BM del paciente, y sugieren que el bloqueo en el desarrollo se produce distante a la etapa progenitora (29-30) .

El efecto del Cobre en las líneas celulares: El efecto del Cobre también se estudió in vitro en líneas celulares establecidas (31-34) . Una línea tal (HL-60) se derivó de un paciente con leucemia promielocítica aguda. Estas células, que tienen las características de mieloblastos y promielocitos, pueden crecer indefinidamente en cultivo. Tras la adición de diversos agentes, tales como ácido retinoico (RA) , al medio de cultivo, las células experimentan diferenciación, que da como resultado células que demuestran algunas, pero no todas, de las características de granulocitos maduros.

El estudio del estado del Cobre en estas células ha mostrado que aunque el contenido de Cobre citosólico por célula no fue significativamente diferente en células tratadas con RA en comparación con células no tratadas, el contenido de Cobre por contenido de proteína se dobló. Esto se debe al hecho de que las células tratadas con RA tienen aproximadamente la mitad de contenido de proteína en comparación con su homólogo no tratado. Usando 67Cu, también se ha mostrado que la velocidad de captación de Cobre fue significativamente más rápida durante los dos primeros días de tratamiento con RA, pero no en momentos posteriores. La distribución intracelular de 67Cu se descubrió predominantemente en fracciones de peso molecular (PM) alto (> 100 kD) y una fracción de PM inferior de aproximadamente 20 kD, con una proporción más alta de Cobre presente en las fracciones de PM alto en células tratadas con RA.

La adición de Cobre en exceso a medio de crecimiento complementado con suero regular aumentó modestamente la diferenciación inducida por RA. Aunque las células HL-60 tratadas con RA no representan necesariamente desarrollo celular normal, estos resultados apuntan a la posibilidad de que la diferenciación de neutrófilos pueda requerir Cobre.

En otros experimentos se ha mostrado que pueden prepararse células HL-60 deficientes en Cobre... [Seguir leyendo]

1. Una población de células madre hematopoyéticas expandida obtenida por cultivo ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal sembradas en un medio de cultivo que proporciona a dichas células madre condiciones para proliferación celular y en presencia de tetraetilenpentamina (TEPA) , en la que dicho medio de cultivo comprende citocinas de actuación temprana; y

en la que dicha TEPA y dichas condiciones de proliferación dan como resultado (i) mayor proliferación de células madre prolongada; (ii) mayor expansión a largo de plazo de células clonogénicas; y (iii) mantenimiento de un mayor porcentaje de células madre de sangre del cordón umbilical indiferenciadas en su estado indiferenciado en comparación con células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical cultivadas en presencia de dichas condiciones de proliferación y en ausencia de TEPA,

inhibiendo de este modo la diferenciación, permitiendo a la vez la expansión de dicha población de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical en dicho medio de cultivo,

y en la que dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical por lo tanto se expanden pero no se diferencian más en comparación con células madre de sangre del cordón umbilical sembradas ex vivo de las que se expandió dicha población de células madre y progenitoras hematopoyéticas expandida.

2. La población de células madre y progenitoras expandidas de la reivindicación 1, en la que dichas células madre sembradas se enriquecen con respecto a células hematopoyéticas progenitoras tempranas no diferenciadas.

3. La población de células madre de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas sembradas se enriquecen con respecto a células CD34+ hematopoyéticas.

4. La población de células madre de la reivindicación 1, en la que dichas citocinas de actuación temprana se seleccionan del grupo que consiste en factor de células madre, ligando de FLT3, interleucina-6, trombopoyetina e interleucina-3.

5. La población de células madre de la reivindicación 1, en la que el medio de cultivo comprende adicionalmente citocinas de actuación tardía.

6. La población de células madre de la reivindicación 5, en la que dichas citocinas de actuación tardía se seleccionan del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos y eritropoyetina.

7. La población de células madre y progenitoras expandidas de la reivindicación 1, en la que dichas células madre y progenitoras se transducen con un exogén.

8. Una composición farmacéutica que comprende la población de células madre y progenitoras de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un procedimiento para expandir células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal ex vivo, inhibiendo a la vez la diferenciación de dichas células madre y progenitoras, comprendiendo el procedimiento proporcionar a dichas células madre y progenitoras de sangre de cordón umbilical ex vivo condiciones para proliferación celular y tetraetilenpentamina (TEPA) , en el que dichas condiciones para proliferación incluyen proporcionar citocinas de actuación temprana; y en el que dicha TEPA y dichas condiciones de proliferación dan como resultado (i) mayor proliferación prolongada; (ii) mayor expansión a largo de plazo de células clonogénicas (cUFC) ; y (iii) mantenimiento de un mayor porcentaje de células indiferenciadas en su estado indiferenciado, en comparación con células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical neonatal en presencia de dichas condiciones de proliferación y en ausencia de TEPA; inhibiendo de este modo la diferenciación y expandiendo dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical ex vivo.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dichas citocinas de actuación temprana se seleccionan del grupo que consiste en factor de células madre, ligando de FLT3, interleucina-6, trombopoyetina e interleucina-3.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente proporcionar citocinas de actuación tardía.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dichas citocinas de actuación tardía se seleccionan del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos y eritropoyetina.

13. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dichas células madre y progenitoras hematopoyéticas son células hematopoyéticas tempranas y/o células progenitoras hematopoyéticas.

14. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente la etapa de seleccionar una población de células hematopoyéticas enriquecidas con respecto a células madre hematopoyéticas.

15. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dichas células madre se enriquecen con respecto a células CD34+ hematopoyéticas.

16. Un procedimiento para transducir células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal indiferenciadas expandidas con un exogén, comprendiendo el procedimiento:

(a) expandir e inhibir diferenciación de células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical:

(i) proporcionando a dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical condiciones para proliferación celular, en las que las que dichas condiciones para proliferación celular comprenden proporcionar citocinas de actuación temprana,

(ii) poniendo en contacto dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical con

tetraetilenpentamina (TEPA) , en las que dicha TEPA y dichas condiciones de proliferación dan como resultado mayor proliferación prolongada; mayor expansión a largo de plazo de células clonogénicas (cUFC) ; y mantenimiento de un mayor porcentaje de células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical indiferenciadas en su estado indiferenciado, en comparación con células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical neonatal en presencia de dichas

condiciones de proliferación y en ausencia de TEPA; inhibiendo de este modo la diferenciación y expandiendo dichas células madre y progenitoras ex vivo; y

(b) transducir dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical indiferenciadas expandidas con el exogén.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha transducción se efectúa por un vector que incluye el 20 exogén.

18. Un procedimiento para preparar células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal indiferenciadas expandidas para trasplante a un receptor, comprendiendo el procedimiento:

(a) expandir e inhibir la diferenciación de dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical:

(i) proporcionando a dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical condiciones para proliferación celular, en las que dichas condiciones para proliferación celular comprenden proporcionar citocinas de actuación temprana;

(ii) poniendo en contacto dichas células madre y progenitoras con tetraetilenpentamina (TEPA) , en

las que dicha TEPA y dichas condiciones de proliferación dan como resultado mayor proliferación 30 prolongada,

mayor expansión a largo de plazo de células clonogénicas (cUFC) , y mantenimiento de un mayor porcentaje de células indiferenciadas en su estado indiferenciado, en comparación con células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical neonatal cultivadas en presencia de dichas condiciones de proliferación y en ausencia de TEPA, inhibiendo de este modo la diferenciación y

expandiendo dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical ex vivo; y

(b) aislar dichas células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical indiferenciadas expandidas.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente la etapa de seleccionar una población de células hematopoyéticas enriquecidas con respecto a células madre hematopoyéticas.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dichas células madre hematopoyéticas se enriquecen con 40 respecto a células CD34+ hematopoyéticas.

21. Un procedimiento de conservación de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical neonatal indiferenciadas que comprende poner en contacto las células madre y progenitoras de sangre del cordón umbilical neonatal indiferenciadas con tetraetilenpentamina (TEPA) ; y en el que dicho contacto se realiza en al menos una de las etapas de recoger, aislar y almacenar las células madre y progenitoras de sangre del cordón

45 umbilical indiferenciadas.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dichas células madre y progenitoras son células madre hematopoyéticas.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dichas células madre hematopoyéticas se enriquecen con respecto a células CD34+.

50 24. Una bolsa de recogida de células madre, complementada con una cantidad de tetraetilenpentamina (TEPA) suficiente para inhibir la diferenciación de una población de células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical indiferenciadas, en la que dichas células madre son células madre y progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical indiferenciadas.