Composiciones y métodos para la detección de afecciones precancerosas en muestras de células y tejidos utilizando 5, 10, 15, 20-tetrakis(carboxifenil)porfina.

Método para determinar si una muestra de células contiene células displásicas o carcinómicas,

comprendiendo el método:

a) poner en contacto la muestra con una solución de 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) profina (TCPP) bajo condiciones que permiten la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP disuelto con anterioridad en base de alcohol y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar el TCPP no unido de la muestra; y

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, siendo indicativa la presencia de fluorescencia de TCPP de que la muestra contiene células displásicas o carcinómicas.

Composiciones y métodos para la detección de afecciones precancerosas en muestras de células y tejidos utilizando 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina Sector de la invención La presente invención se refiere a la utilización de ciertas porfirinas para detectar células displásicas, precancerosas y cancerosas a partir de diferentes muestras de tejidos, tanto in vitro como in situ.

Antecedentes de la invención Se hace referencia a varios artículos científicos y académicos entre paréntesis en la presente solicitud.

Los patólogos, que examinan la progresión de la enfermedad y analizan muestras de tejidos para detectar anomalías, tales como cáncer, han determinado que una afección celular denominada displasia, que se refiere a la formación o maduración anormal de las células, puede potencialmente identificar células en una condición precancerosa. Si no se controla, la displasia puede progresar a las etapas leve, moderada y grave y eventualmente al cáncer. Aproximadamente uno de cada siete casos moderados de displasia se convertirán en cáncer y se ha informado que hasta un 83% de los casos con displasia grave se convierten en cáncer, dependiendo de los tipos de células involucradas. Sin embargo, la eliminación de displasias leves y moderadas reduce en gran medida el desarrollo del cáncer. En el pulmón, la eliminación de células displásicas no sólo reduce en gran medida la formación de células cancerosas, sino que en algunos casos el tejido pulmonar volverá a una morfología normal.

En general, mientras más temprano se detecta el cáncer, mejor será el pronóstico para la supervivencia del paciente. Si el cáncer de mama se detecta temprano, cuando todavía está localizado en una sola masa, la tasa de supervivencia hasta cinco años es más del 96%. Cuando se ha extendido a un lugar distante, la tasa de supervivencia hasta cinco años es inferior al 20%. Para el cáncer de pulmón, cuando se detecta como una sola masa, la supervivencia hasta 5 años es más del 46%. Cuando se ha diseminado, la supervivencia hasta cinco años es inferior al 14%. Para el cáncer de cuello de útero, se produce una mejoría adicional en la supervivencia cuando se detectan cambios precancerosos y se tratan antes de desarrollarse a una etapa más grave (Boring y Squires 1993, CA Cancer J Clin 43: 7-26 y Ferguson 1990, Hematología Oncol Clin Nam 4: 1053-1168) .

El carcinoma de pulmón es actualmente la principal causa de mortalidad por cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos (Wingo y otros. 1995, CA J Clin Clínica 45: 8-30) . En 1997, se estimaba que habían 160.000 muertes por cáncer de pulmón, lo que representa el 12% de las muertes por cáncer en hombres de Estados Unidos y el 2% en las mujeres de Estados Unidos (Boring & Squires 1993, supra) . El cáncer de pulmón es también uno de los tipos más letales de cáncer, como se refleja en una tasa de supervivencia hasta cinco años de sólo el 14%. El mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón, en relación con otros tipos de cáncer humanos, se debe en gran parte a la falta de métodos eficaces de detección precoz. En el momento de la presentación clínica (sintomática) , más de dos tercios de todos los pacientes tienen afectación de nódulos regionales o metástasis a distancia, las cuales son, por lo general, incurables. En estudios de pacientes con cáncer de pulmón localizado (Etapa 0 ó 1) , sin embargo, las tasas de supervivencia hasta 5 años han variado desde un 40% a un 70% (Boring y Squires, 1993, supra; Ferguson, 1990, supra) .

Históricamente, las únicas pruebas de diagnóstico utilizadas para detectar cáncer de pulmón antes presentar síntomas han sido la citología de esputo y la radiografía de tórax. Como consecuencia, la eficacia de estas pruebas como herramientas de cribado poblacional ha sido ampliamente evaluada en estudios en los últimos decenios. Ambas pruebas detectan carcinoma en etapa temprana presintomático, en particular, el carcinoma de células escamosas.

Las mejoras en los métodos de cribado se han centrado principalmente en torno a mejorar la utilidad de la citología de esputo a través de los avances tecnológicos en microscopía. La citología de esputo requiere un examen visual de una muestra de células durante el que se utiliza el tamaño de la célula, la forma, la organización y una relación entre el tamaño del núcleo de la célula y el citoplasma para determinar la morfología de la célula. Debido a que esta evaluación de la morfología celular requiere una inspección visual y clasificación, la técnica requiere una cantidad significativa de conocimientos adquiridos por el observador clínico. Se han realizado diversas investigaciones con resultados que sugieren que el análisis de imágenes de alta resolución asistido por ordenador permite la detección de cambios subvisuales en los núcleos visualmente normales asociados con varios tipos de tejidos (Montag y otros. 1991, Anal Quant Cytol Histol 13: 159-167; Haroske y otros. 1988, Arch. Geschwulstforsch, 58: 159-168; Hutchinson y otros. 1992, Anal Quant Cytol Estol 4: 330-334) . El análisis asistido por ordenador de la distribución de ADN en muestras de células ha proporcionado un 74% de clasificación morfológica correcta de los núcleos sin revisión humana del material y sin la necesidad de que estén presente núcleos visualmente anormales cuando se compara con las pruebas citológicas estándar.

La evaluación morfológica de las muestras citológicas también ha mejorado debido a los avances en la comprensión de la patología del tumor de pulmón. Gran parte de este trabajo se ha centrado en la identificación de "biomarcadores". Biomarcadores se refiere a una amplia gama de anormalidades fenotípicas y genéticas progresivas de la mucosa respiratoria que pueden ser utilizadas para determinar el potencial del epitelio bronquial para transformarse completamente en un tumor maligno. Los marcadores han sido ampliamente clasificados como de cambios morfológicos, marcadores inmuno/histoquímicos de proteínas expresadas diferencialmente, marcadores de inestabilidad genómica, marcadores de cambio epigenético (por ejemplo, metilación anormal) , y de mutaciones genéticas (Hirsch y otros. 1997, Lung Cancer 17: 163-174) .

Los niveles de expresión de estos marcadores están siendo evaluados en muestras de tejido cito/histológicas displásicas y neoplásicas colectadas de poblaciones de alto riesgo. Entre las muestras que en la actualidad están siendo objeto de análisis de marcador exploratorio se encuentra el esputo. El interés en las muestras de esputo para la investigación de biomarcadores se ha generado a partir de la creencia largamente sostenida de que las células exfoliadas recuperadas en el esputo pueden ser la indicación más temprana posible de un carcinoma incipiente, ya que el cáncer de pulmón se desarrolla con más frecuencia en el epitelio bronquial. Mediante la aplicación de sofisticadas técnicas de genética molecular (por ejemplo, ensayos basados en PCR) , los estudios están aportando evidencia de que los biomarcadores seleccionados pueden ser detectados en el esputo (Mao y otros. 1994, Cancer Res. 54: 16341637; Mao y otros. 1994, Proc Natl Acad Sci USA. 91: 9871-9875; Sidransky 1995, J Natl Cancer Inst

87: 1201-1202; Tockman y otros. 1988, J. Clin Oncol, 11: 1685-1693; Tockman y otros. 1994, Chest, 106: 385s390s) .

Los servicios de cribado o detección de cáncer comercialmente disponibles se basan en ensayos basados en el diagnóstico citomorfológico por clínicos entrenados que observan cada muestra y determinan la extensión y la identidad de los tipos de células anormales. Este proceso no sólo es caro y requiere de mucho tiempo, sino también introduce el juicio humano y, por lo tanto, error en el procedimiento. Recientemente, ha sido desarrollado un método para la detección de células cancerosas de pulmón a través de la utilización de 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina (TCPP) (Patente de EE.UU. Núm. 5.162.231 de Cole y otros.) Este método se basa en la propensión de las células cancerosas a acumular TCPP de su entorno en una cantidad mayor que las células no cancerosas. Tras la incubación de una muestra de células durante 6-24 horas con 200 μg/ml de TCPP, TCPP entra en las células y se une a la membrana perinuclear y a las mitocondrias de las células neoplásicas. La TCPP fluoresce bajo luz ultravioleta, y de esta manera las células cancerosas pueden ser diagnosticadas únicamente por la intensidad de fluorescencia, sin hacer referencia a la morfología. La Patente de EE.UU. Núm. 6.190.877 de Adair y otros da a conocer un método... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar si una muestra de células contiene células displásicas o carcinómicas, comprendiendo el método:

a) poner en contacto la muestra con una solución de 5, 10, 15.

2. tetrakis (carboxifenil) profina (TCPP) bajo condiciones que permiten la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP disuelto con anterioridad en base de alcohol y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar el TCPP no unido de la muestra; y

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, siendo indicativa la presencia de fluorescencia de TCPP de que la muestra contiene células displásicas o carcinómicas.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende muestras de esputo, hisopos cervicales, lavados bronquiales, aspiración con aguja fina o biopsias de núcleo de tiroides o de mama, lavados de vejiga y lavados bucales.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que la muestra se fija en un fijador seleccionado del grupo que comprende formaldehído, metanol, etanol, isopropanol y cualquier combinación de los mismos.

4. Método, según la reivindicación 3, en el que el fijador es etanol al 95%.

5. Método, según la reivindicación 1, en el que la muestra está adherida a un soporte sólido.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que el soporte sólido es un portaobjetos de microscopio.

7. Método, según la reivindicación 1, en el que la muestra se suspende en un medio líquido.

8. Método, según la reivindicación 1, en el que la solución de TCPP está tamponada a un pH entre aproximadamente 5, 8 y aproximadamente 6, 7.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que la solución comprende además uno o más reactivos que reducen la fluorescencia de fondo, evitan la oxidación de TCPP o evitan la extinción de la fluorescencia de TCPP.

10. Método, según la reivindicación 1, en el que la concentración de TCPP en la muestra está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 100 μg/ml.

11. Método, según la reivindicación 1, en el que la muestra se pone en contacto con TCPP durante entre aproximadamente 0, 2 minutos y aproximadamente 2 horas.

12. Método, según la reivindicación 1, en el que durante la puesta en contacto, la muestra se mantiene a una temperatura entre aproximadamente 23º C y aproximadamente 42º C.

13. Método, según la reivindicación 5, en el que la fluorescencia de TCPP en la muestra se detecta visualmente.

14. Método, según la reivindicación 5, en el que la fluorescencia de TCPP en la muestra se detecta con un lector de portaobjetos.

15. Método, según la reivindicación 7, en el que la fluorescencia de TCPP se detecta con un citómetro de flujo fluorométrico.

16. Método, según la reivindicación 1, en el que la etapa de detección se lleva a cabo entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 24 horas después de la etapa de eliminación.

17. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinación del porcentaje de células en la muestra que son fluorescentes con TCPP.

18. Método, según la reivindicación 17, en el que las muestras que comprenden más de aproximadamente un 1% de células fluorescentes se clasifican como que contiene células anormales precancerosas o cancerosas.

19. Método, según la reivindicación 17, en el que la etapa de determinación del porcentaje de células en la muestra que son fluorescentes con TCPP comprende cuantificar la intensidad de fluorescencia de TCPP en la muestra de una manera que correlaciona la intensidad de fluorescencia con un porcentaje de células en la muestra que contiene TCPP.

20. Método, según la reivindicación 19, en el que la fluorescencia de TCPP se cuantifica poniendo en contacto la muestra con un marcador detectable que se une a todas las células en la muestra, eliminando el marcador detectable no unido y estableciendo una relación de fluorescencia de TCPP y la cantidad del marcador detectable en

la muestra.

21. Método, según la reivindicación 20, en el que el marcador detectable es un compuesto fluorescente.

22. Método, según la reivindicación 1, que comprende además, tras la detección de la fluorescencia de TCPP en la 10 muestra, la caracterización de las células fluorescentes en metaplasia, displasia o carcinoma.

23. Método, según la reivindicación 22, en el que la caracterización comprende clasificar la intensidad de fluorescencia de las células fluorescentes y correlacionar la intensidad de fluorescencia con el estado metaplásico, displásico o carcinómico de las células.

24. Método, según la reivindicación 22, en el que la caracterización comprende clasificar las células fluorescentes en una o más características morfológicas seleccionados del grupo que comprende la forma celular, tamaño de la célula, agrupamiento de las células, cantidad de degeneración de las células o grupos de células, el número de núcleos, el tamaño de los núcleos, visibilidad de la membrana celular y la presencia de residuos nucleares, y correlacionar las características morfológicas con el estado metaplásico, displásico o carcinómico de las células.

25. Método, según la reivindicación 22, en el que la caracterización comprende clasificar las células fluorescentes por la intensidad de fluorescencia y por una o más características morfológicas seleccionadas del grupo que comprende la forma celular, tamaño de la célula, agrupamiento de las células, la cantidad de la degeneración de las células o grupos de células, el número de núcleos, el tamaño de los núcleos, visibilidad de la membrana celular y la presencia de residuos nucleares, y correlacionar la intensidad de fluorescencia y las características morfológicas con el estado metaplásico, displásico o carcinómico de las células.

26. Método, según la reivindicación 25, en el que el número total de las características morfológicas y la intensidad de fluorescencia que muestran las células fluorescentes se utilizan como un factor en la caracterización de las células fluorescentes en metaplasia, displasia o carcinoma.

27. Método, según la reivindicación 25, en el que el patrón de las características morfológicas y la intensidad de fluorescencia se utilizan como un factor en la caracterización de las células fluorescentes en metaplasia, displasia o 35 carcinoma.

28. Método, según la reivindicación 22, en el que las células fluorescentes en la muestra se comparan con las células no fluorescentes de la misma muestra o de una segunda muestra del mismo paciente.

29. Método, según la reivindicación 28, en el que las células fluorescentes se separan de las células no fluorescentes por citometría de flujo fluorométrico.

30. Método de detección de cáncer en estadio temprano o de una condición precancerosa de un tejido u órgano seleccionado, comprendiendo el método:

45 a) determinar si la muestra de células, obtenida a partir del tejido u órgano seleccionado, contiene células anormales precancerosas o cancerosas mediante el método según la reivindicación 1, una determinación positiva de la misma es indicativo de una detección positiva de cáncer en etapa temprana o una condición precancerosa del tejido u órgano seleccionado.

31. Método de detección de células displásicas o carcinómicas en un tejido diana seleccionado, comprendiendo el método:

a) introducir en la muestra de tejido diana una solución de TCPP bajo condiciones que permiten la unión de TCPP a 55 los componentes de las células displásicas o carcinómicas , si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP disuelto con anterioridad en base de alcohol y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar TCPP no unido del tejido diana; y 60 c) detectar la fluorescencia de TCPP en las células del tejido diana, siendo indicativa la presencia de fluorescencia de TCPP en las mismas de que el tejido diana contiene células displásicas o carcinómicas.

32. Método, según la reivindicación 31, en el que el tejido diana se selecciona del grupo que comprende pulmón, mama, glándula prostática, cuello del útero, garganta, vejiga, orofaringe, piel y tracto gastrointestinal.